HCN1チャネルタンパク質のカルシウム依存性結合毛細胞ステレオセリリーチップリンクタンパク質プロトカダリン15 CD3

トラウト嚢状有毛細胞で発現する主要な完全長HCNアイソフォームであるHCN1の細胞質アミノ末端は、酵母の2ハイブリッドプロトコルによって発見され、プロトカダリン15a様タンパク質の細胞質カルボキシル末端ドメインが結合しました。HCN1は、プロトカドヘリン15Aのチップリンク部位に期待される段階的分布と一致して、秘密の有毛細胞の立体上の個別の部位に免疫局在していました。HCN1メッセージは、ラットcoch牛の内側および外側有毛細胞のcDNAライブラリでも検出され、HCN1タンパク質はco牛の毛細胞の立体に免疫局在しました。マス有毛細胞モデルで予測されているように、コルチHCN1のラット臓器のアミノ末端は、酵母の2ハイブリッド分析によって発見され、プロトカドヘリン15 CD3のカルボキシル末端に結合しました。HCN1とプロトカダリン15 CD3の間の特異的結合は、プルダウンアッセイと表面プラズモン共鳴分析で確認され、どちらもCa（2+）への依存を予測しました。カルシウムキレート剤の存在下では、HCN1とプロトカドヘリン15 CD3の間の結合は、k（d）= 2.39 x 10（-7）mによって特徴付けられました。26.5-68.0のCa（2+）は、K（d）= 5.26 x 10（-8）m（61 microM ca（2+））で結合を促進しました。プロトカドヘリン15 CD3の欠失変異体による結合は、アミノ酸158-179（GenBankアクセッション番号XP_238200）を指し、HCN1への結合に必要なトラウト毛細胞プロトカドヘリン15A様タンパク質の同等の領域と相同性。HCN1のHCN1チャネル形成の根底にあると仮定されたHCN1のアミノ末端結合は、CA（2+）依存性であることがわかりましたが、結合はHCN1相互作用よりも低い有効な最大[Ca（2+）]に向かって歪んでいました。プロトカドヘリン15 CD3を使用。したがって、HCN1の2つの結合部位の間に競争が存在する可能性があり、HCN1のプロトカドヘリン15 CD3への結合は26.5〜68 MicroM Ca（2+）を支持します。まとめると、この証拠は、内耳細胞の機械感覚形質導入におけるHCN1の役割を支持しています。

The cytoplasmic amino terminus of HCN1, the primary full-length HCN isoform expressed in trout saccular hair cells, was found by yeast two-hybrid protocols to bind the cytoplasmic carboxyl-terminal domain of a protocadherin 15a-like protein. HCN1 was immunolocalized to discrete sites on saccular hair cell stereocilia, consistent with gradated distribution expected for tip link sites of protocadherin 15a. HCN1 message was also detected in cDNA libraries of rat cochlear inner and outer hair cells, and HCN1 protein was immunolocalized to cochlear hair cell stereocilia. As predicted by the trout hair cell model, the amino terminus of rat organ of Corti HCN1 was found by yeast two-hybrid analysis to bind the carboxyl terminus of protocadherin 15 CD3, a tip link protein implicated in mechanosensory transduction. Specific binding between HCN1 and protocadherin 15 CD3 was confirmed with pull-down assays and surface plasmon resonance analysis, both predicting dependence on Ca(2+). In the presence of calcium chelators, binding between HCN1 and protocadherin 15 CD3 was characterized by a K(D) = 2.39 x 10(-7) m. Ca(2+) at 26.5-68.0 microm promoted binding, with K(D) = 5.26 x 10(-8) m (at 61 microm Ca(2+)). Binding by deletion mutants of protocadherin 15 CD3 pointed to amino acids 158-179 (GenBank accession number XP_238200), with homology to the comparable region in trout hair cell protocadherin 15a-like protein, as necessary for binding to HCN1. Amino terminus binding of HCN1 to HCN1, hypothesized to underlie HCN1 channel formation, was also found to be Ca(2+)-dependent, although the binding was skewed toward a lower effective maximum [Ca(2+)] than for the HCN1 interaction with protocadherin 15 CD3. Competition may therefore exist in vivo between the two binding sites for HCN1, with binding of HCN1 to protocadherin 15 CD3 favored between 26.5 and 68 microm Ca(2+). Taken together, the evidence supports a role for HCN1 in mechanosensory transduction of inner ear hair cells.