ゼブラフィッシュのハウスキーピング遺伝子の特徴付け：オスとメスの違いと、組織タイプ、発生段階、および化学処理の影響

背景：ゼブラフィッシュモデルを使用した研究は、近年急速に成長しています。内部参照（「ハウスキーピング」）遺伝子に正規化されたリアルタイムの逆転写PCR（QPCR）は、ゼブラフィッシュの遺伝子発現変化を定量化するために頻繁に使用される方法ですが、多くの一般的に使用されるハウスキーピング遺伝子は実験条件で異なることが知られています。異なる実験条件下で安定して発現し、したがってゼブラフィッシュのQPCRのノルマイザーとして適切なハウスキーピング遺伝子を特定するために、本研究では、発達中および発達中およびホルモン/毒性曝露の関数として、一般的に使用される8つのハウスキーピング遺伝子の発現を評価しました。大人の魚の組織の種類と性別。 結果：QPCR分析を使用して、Bactin1、チューブリンアルファ1（TUBA1）、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）、TATA-ボックスバンディングPROT（TBP）、BETA-2-ミクログロブリン（B2M）、伸長因子1アルファ（ELFA）、および発達中の18SリボソームRNA（18S）（2〜120時間の浸透後、HPF）;成人男性と女性のさまざまな組織タイプ（脳、目、肝臓、心臓、筋肉、生殖腺）で。また、胚/幼虫（24-96 HPF）の治療後、一般的に使用される車両と、既知の環境内分泌かく乱物質を表す薬剤のために使用されます。すべての遺伝子は、ここでテストされた条件下である程度の変動性があることがわかりました。Genorm分析を使用した発現安定性のランク順序付けにより、18S、B2M、およびELFAが開発中および組織タイプ全体で最も安定していると特定されましたが、GAPDH、TUBA1、およびTPBが最も変動しました。化学処理後、Tuba1、Bactin1、およびELFAは最も安定に発現していましたが、TBP、18S、およびB2Mは最も安定していませんでした。データはまた、遺伝子および組織特異的である性差、および遺伝子、媒体、リガンド特異的である治療効果を明らかにしました。QPCR分析の精度を異なる参照遺伝子を使用してテストして、エストロゲン受容体拮抗薬によるCYP19A1Bの抑制とアリールヒドロカーボン受容体アゴニストによるCYP1Aの誘導を測定した場合、安定した不安定な遺伝子を伴う効果の方向と大きさが異なりました。 結論：この研究は、将来の研究のためのハウスキーピング遺伝子の最初の選択にゼブラフィッシュの研究者を支援することが期待できるデータを提供しますが、新しい実験パラダイムと魚種ごとにハウスキーピング遺伝子をさらに検証することの重要性を強調しています。

BACKGROUND: Research using the zebrafish model has experienced a rapid growth in recent years. Although real-time reverse transcription PCR (QPCR), normalized to an internal reference ("housekeeping") gene, is a frequently used method for quantifying gene expression changes in zebrafish, many commonly used housekeeping genes are known to vary with experimental conditions. To identify housekeeping genes that are stably expressed under different experimental conditions, and thus suitable as normalizers for QPCR in zebrafish, the present study evaluated the expression of eight commonly used housekeeping genes as a function of stage and hormone/toxicant exposure during development, and by tissue type and sex in adult fish. RESULTS: QPCR analysis was used to quantify mRNA levels of bactin1, tubulin alpha 1(tuba1), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd), TATA-box binding protein (tbp), beta-2-microglobulin (b2m), elongation factor 1 alpha (elfa), and 18s ribosomal RNA (18s) during development (2 - 120 hr postfertilization, hpf); in different tissue types (brain, eye, liver, heart, muscle, gonads) of adult males and females; and after treatment of embryos/larvae (24 - 96 hpf) with commonly used vehicles for administration and agents that represent known environmental endocrine disruptors. All genes were found to have some degree of variability under the conditions tested here. Rank ordering of expression stability using geNorm analysis identified 18s, b2m, and elfa as most stable during development and across tissue types, while gapdh, tuba1, and tpb were the most variable. Following chemical treatment, tuba1, bactin1, and elfa were the most stably expressed whereas tbp, 18s, and b2m were the least stable. Data also revealed sex differences that are gene- and tissue-specific, and treatment effects that are gene-, vehicle- and ligand-specific. When the accuracy of QPCR analysis was tested using different reference genes to measure suppression of cyp19a1b by an estrogen receptor antagonist and induction of cyp1a by an arylhydrocarbon receptor agonist, the direction and magnitude of effects with stable and unstable genes differed. CONCLUSION: This study provides data that can be expected to aid zebrafish researchers in their initial choice of housekeeping genes for future studies, but underlines the importance of further validating housekeeping genes for each new experimental paradigm and fish species.