2Aペプチドベースのレンチウイルスベクターを使用して、複数の遺伝子の同時発現のための安定した哺乳類細胞株の生成

現在、複数の外因性遺伝子を安定して発現する哺乳類細胞の生成は現在困難です。ここでは、このプロセスを促進する戦略を提供します。まず、ウイルス2Aペプチドの3つのコーディング配列を含むヘルパーベクターP2Aが構築されました。赤蛍光タンパク質（DSRED）、ホタルルシフェラーゼ（FLUC）、および強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードする3つのレポーター遺伝子をP2Aに挿入して、その後レンティウイルスベクターにサブクローニングされた融合オープンリーディングフレームを形成しました。伝達後、EGFP陽性293T細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングによって選択されました。選択された細胞における外因性遺伝子の発現は、15を超える通路で安定しており、EGFP陽性細胞は95％を超えていました。2a-ペプチド媒介ポリタンパク質の効率的な切断も観察され、3つのレポータータンパク質すべてが機能的でした。したがって、安定したdsred/fluc/egfp-expressing細胞株が短時間で容易に確立されました。この戦略は、基礎研究とタンパク質生産に役立つ可能性があります。

Generation of mammalian cells stably expressing multiple exogenous genes is currently difficult. Here we provide a strategy to facilitate this process. First, a helper vector p2A containing three coding sequences for viral 2A peptides was constructed. Three reporter genes coding for red fluorescent protein (DsRed), firefly luciferase (Fluc) and enhanced green fluorescent protein (EGFP) were then inserted into p2A to form a fusion open reading frame that was subsequently subcloned into a lentiviral vector. After transduction, EGFP-positive 293T cells were selected by fluorescence activated cell sorting. The expression of exogenous genes in selected cells was stable for more than 15 passages, and EGFP-positive cells were over 95%. The efficient cleavages of 2A-peptide mediated polyprotein were also observed and all three reporter proteins were functional. Thus, a stable DsRed/Fluc/EGFP-coexpressing cell line was readily established within a short time. The strategy could be useful for basic research and protein production.