タンパク質熱可塑の知識誘導実験室の進化

まれであるが、それにもかかわらず、酵素の熱安定性を低下させること、つまり制御された方法で熱可視を増加させることは、実際的に興味深いものです。現在のモデル研究では、この型にはまらない目標は、Pseudomonas aeruginosa（PAL）のリパーゼに指示された進化を適用することで到達しました。以前に酵素の熱安定性を増加させるために開発されたBファクター反復検査（B-FIT）を利用することにより、野生型（WT-PAL）の場合、T（15）（50）の値を35.6度C（ベストミュータント）に減らすことができました。したがって、飽和変異誘発はPALのサイトで行われました。PALのサイトは、そのX線構造に基づいて、高い剛性を示す最低のBファクターを持っています。焦点を絞った突然変異が導入されました。これは、剛性を低下させると予想され、その後の柔軟性が増加すると、実際の触媒プロファイルを変えることなく熱可力が高くなります。

In rare but nevertheless important cases it is of practical interest to decrease the thermostability of an enzyme, that is, to increase thermolability in a controlled manner. In the present model study, this unconventional goal has been reached by applying directed evolution to the lipase from Pseudomonas aeruginosa (PAL). By utilizing the B-factor iterative test (B-FIT), previously developed to increase the thermostability of enzymes, it was possible to reduce the T(15)(50) value from 71.6 degrees C in the case of wild type (WT-PAL) to 35.6 degrees C (best mutant) without affecting the catalytic profile in terms of substrate acceptance or enantioselectivity at room temperature. Accordingly, saturation mutagenesis was performed at sites in PAL, which on the basis of its X-ray structure, have the lowest B-factors indicative of high rigidity. Focused mutations were introduced which can be expected to decrease rigidity, the ensuing increased flexibility leading to higher thermolability without changing the actual catalytic profile.