一酸化窒素合成酵素反応の2番目のステップ：活性酸化剤としての第四葉の証拠

一酸化窒素合成酵素（NOS）は、L-アルギニンのシトルリンへの酸化を触媒するp450モノオキシゲナーゼであり、安定した中間n（g） - ヒドロキシ-L-アルギニン（NHA）を介してNOを介してNOを触媒します。NOSによるNHAの酸化はユニークです。この変換の原因となるヘム結合酸化剤[すなわち、鉄 - ペロキソ対Fe（IV）O（POR（*+））]の性質を支持する直接的な証拠はほとんどありません。NOSによるH（2）o（2）駆動型NHAの酸化を特徴付ける以前の研究では、シトルリンとサイド産物N（Delta）-CyanOornithine（CN-ORN）の形成が示されました。これは、シトルリンへのNHAの酸化における鉄骨中間体の提案された関与につながりました。この仮説をテストするために、このモデル反応を使用して、PH、ヘム置換、活性部位変異誘発、および蛍光基質類似体の効果を生成物分布における調子を研究しました。さらに、H（2）O（2）およびINOS（HEME）による2,2'-アジノビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）の酸化を使用して、タンパク質触媒触媒崩壊のプローブを調べるために使用しました。Fe（IV）O（POR（*+））中間体への過酸化物。pH 6.5、7.5、および8.5では、過酸化物シャント反応はそれぞれ26 +/- 2、36 +/- 1、および51 +/- 1％シトルリンを形成します。しかし、ペルオキシダーゼ活性の速度はpHと負の相関があり、過酸化物の分解速度は13.1 +/- 0.3、8.3 +/- 0.2、および4.2 +/- 0.1 m（-1）s（-1）s（-1）s（-1）s（-1）s（-1）s（-1）s（-1）s（-1）それぞれ6.5、7.5、および8.5。活性部位バリン346のアラニンへの突然変異により、製品分布は5.2 +/- 0.5％シトルリンにシフトし、過酸化物の切断速度を14.3 +/- 0.7 m（-1）s（-1）に増強しました。ヘム補因子の鉄メソポルフィリンIX（FE-MPIX）による置換により、製品の分布は36 +/- 1％シトルリンから22 +/- 3％シトルリンに変化します。Mnによる金属置換は、64.7 +/- 0.8％シトルリンの形成をもたらします。逆に、電気症4,4-ジフルオロ-N（G） - ヒドロキシ-L-アルギニン基質類似体は、生成物分布を68.6 +/- 0.6％4,4-ジフルオロシトルリンにシフトしました。ペルオキシダーゼデータは、Ferric-Peroxo種のFe（IV）O（POR（*+））中間体への処理を制御するNOSの化学的特徴に関する洞察を提供し、さまざまな条件下で過酸化物シャントに観察された製品分布を解釈するのに役立ちます。すべての場合において、タンパク質の過酸化物を分解する能力は、過酸化物シャントによるシトルリンの形成と負の相関があります。これらの結果は、CN-ORN形成の原因となっている種として、高いバレントFe（IV）O（POR（*+））中間体をサポートし、NHAのシトルリンへの酸化における鉄骨中間体の関与と一致しています。

Nitric oxide synthase (NOS) is a P450 mono-oxygenase that catalyzes the oxidation of l-arginine to citrulline and NO through the stable intermediate N(G)-hydroxy-l-arginine (NHA). The oxidation of NHA by NOS is unique. There is little direct evidence in support of the nature of the heme bound oxidant [i.e., ferric-peroxo vs Fe(IV)O(por(*+))] responsible for this transformation. Previous work characterizing the H(2)O(2)-driven oxidation of NHA by NOS showed the formation of citrulline and the side product N(delta)-cyanoornithine (CN-orn). This led to the proposed involvement of a ferric-peroxo intermediate in the oxidation of NHA to citrulline. To test this hypothesis we used this model reaction to study the effects of pH, heme substitution, active site mutagenesis, and a fluorinated substrate analogue on the product distribution. Further, the oxidation of 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) by H(2)O(2) and iNOS(heme) was used to probe the protein-catalyzed breakdown of peroxide to the Fe(IV)O(por(*+)) intermediate. At pH 6.5, 7.5, and 8.5 the peroxide shunt reaction forms 26 +/- 2, 36 +/- 1, and 51 +/- 1% citrulline, respectively. The rate of peroxidase activity, however, was negatively correlated to pH, with a peroxide breakdown rate of 13.1 +/- 0.3, 8.3 +/- 0.2, and 4.2 +/- 0.1 M(-1) s(-1) at pH 6.5, 7.5, and 8.5, respectively. Mutation of active site valine 346 to an alanine shifted the product distribution to 5.2 +/- 0.5% citrulline while enhancing the peroxide cleavage rate to 14.3 +/- 0.7 M(-1) s(-1). Substitution of the heme cofactor with iron mesoporphyrin IX (Fe-MPIX) alters the product distribution from 36 +/- 1% citrulline to 22 +/- 3% citrulline. Metal substitution with Mn results in the formation of 64.7 +/- 0.8% citrulline. Conversely, the electrophilic 4,4-difluoro-N(G)-hydroxy-l-arginine substrate analogue shifted the product distribution to 68.6 +/- 0.6% 4,4-difluorocitrulline. The peroxidase data provide insight into the chemical features of NOS that control the processing of the ferric-peroxo species to the Fe(IV)O(por(*+)) intermediate and help interpret the product distributions observed for the peroxide shunt under various conditions. In all cases, the ability of the protein to break down peroxide is negatively correlated with the formation of citrulline by the peroxide shunt. These results support the high valent Fe(IV)O(por(*+)) intermediate as the species responsible for CN-orn formation and are consistent with the involvement of the ferric-peroxo intermediate in the oxidation of NHA to citrulline.