硫黄がセレンに取って代わる、大腸菌形成デヒドロゲナーゼ変異体の触媒特性

大腸菌の形成デヒドロゲナーゼHには、セレノシステインが含まれています。システインがセレノシステインに取って代わる酵素の変異型を精製しました。セレノシステインの本質的な触媒的役割を解明するために、変異酵素の運動学的および物理的特性を野生型の役割と比較しました。変異体酵素と野生型酵素は、活性と安定性に関して同様のpH依存性を示しましたが、変異酵素プロファイルはより多くのアルカリ性pHにわずかにシフトされました。両方の酵素は、ヨードアセトアミドとの反応によって不活性化されました。ただし、酵素をアルキル化の影響を受けやすくするためには、基質の添加が必要でした。アルキル化誘発性不活性化はpHに大きく依存しており、各酵素は必須セレノールまたはチオールを示唆するアルキル化とpHプロファイルを示しています。酵素の両方の形態は、ping-pong bi-bi速度論的メカニズムを使用しています。変異酵素は、KMとKDの値の減少によって示されるように、野生型酵素よりも大きな親和性で形成されます。ただし、変異酵素の回転数は、ネイティブセレン含有酵素のそれよりも2桁以上低い離職数を持っています。代替基板下骨酸を使用した運動分析に見られるように、低い回転数は、全体的な反応の初期ステップの反応速度の低下に起因します。これらの結果は、形成デヒドロゲナーゼHのセレンが形成酸化に直接関与していることを示しています。速度論的特性の観察された違いは、酵素の活性部位でのセレノシステインの進化的保存を説明するのに役立つかもしれません。

Formate dehydrogenase H of Escherichia coli contains selenocysteine as an integral amino acid. We have purified a mutant form of the enzyme in which cysteine replaces selenocysteine. To elucidate the essential catalytic role of selenocysteine, kinetic and physical properties of the mutant enzyme were compared with those of wild type. The mutant and wild-type enzymes displayed similar pH dependencies with respect to activity and stability, although the mutant enzyme profiles were slightly shifted to more alkaline pH. Both enzymes were inactivated by reaction with iodoacetamide; however, addition of the substrate, formate, was necessary to render the enzymes susceptible to alkylation. Alkylation-induced inactivation was highly dependent on pH, with each enzyme displaying an alkylation vs. pH profile suggestive of an essential selenol or thiol. Both forms of the enzyme use a ping-pong bi-bi kinetic mechanism. The mutant enzyme binds formate with greater affinity than does the wild-type enzyme, as shown by reduced values of Km and Kd. However, the mutant enzyme has a turnover number which is more than two orders of magnitude lower than that of the native selenium-containing enzyme. The lower turnover number results from a diminished reaction rate for the initial step of the overall reaction, as found in kinetic analyses that employed the alternative substrate deuterioformate. These results indicate that the selenium of formate dehydrogenase H is directly involved in formate oxidation. The observed differences in kinetic properties may help explain the evolutionary conservation of selenocysteine at the enzyme's active site.