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大腸菌におけるTN7を介した転位により、組換えBombyx mori（silkworm）多核亜酸化症を生成するための高効率の方法が実施されました。新しいシステムは、条件付き複製ドナーベクターPRCDMとBMNPV-BACMIDを含む大腸菌をブロックしたATTTN7部位で構成されています。ドナーベクターには、R6KGAMMAに由来する複製起点が含まれています。R6KGAMMAは、PIR遺伝子発現を持つ宿主細胞でのみ伝播し、転位バックグラウンドでは大幅に減少しました。PUCに由来する元のベクトルと比較して、条件付き複製ベクターPRCDM転置を元のBMDH10BACに使用すると、転位効率は5.7から66％（約10倍）に増加しました。宿主大腸菌ゲノムのATTTN7部位をブロックすることにより、転置バックグラウンドを減らすためのさらなる努力が行われました。結果として得られるATTTN7は、BMDH10BACDELTATN7を占有したため、転位により組換えBMNPV BACMIDを生成する有効性が5.7から23％（約4倍）に大幅に増加しました。さらに、BMDH10BACDELTATN7のPRCDMの転置は、通常100％白いコロニーで生じ、ゼロ転置バックグラウンドが達成されたことを示しました。この高効率でゼロのバックグラウンド転位システムは、標的遺伝子を発現したり、シルクウォームで遺伝子配達ウイルス粒子を生成するために使用される組換えBMNPVを構築するための新しいシンプルで迅速な方法を提供します。
大腸菌におけるTN7を介した転位により、組換えBombyx mori（silkworm）多核亜酸化症を生成するための高効率の方法が実施されました。新しいシステムは、条件付き複製ドナーベクターPRCDMとBMNPV-BACMIDを含む大腸菌をブロックしたATTTN7部位で構成されています。ドナーベクターには、R6KGAMMAに由来する複製起点が含まれています。R6KGAMMAは、PIR遺伝子発現を持つ宿主細胞でのみ伝播し、転位バックグラウンドでは大幅に減少しました。PUCに由来する元のベクトルと比較して、条件付き複製ベクターPRCDM転置を元のBMDH10BACに使用すると、転位効率は5.7から66％（約10倍）に増加しました。宿主大腸菌ゲノムのATTTN7部位をブロックすることにより、転置バックグラウンドを減らすためのさらなる努力が行われました。結果として得られるATTTN7は、BMDH10BACDELTATN7を占有したため、転位により組換えBMNPV BACMIDを生成する有効性が5.7から23％（約4倍）に大幅に増加しました。さらに、BMDH10BACDELTATN7のPRCDMの転置は、通常100％白いコロニーで生じ、ゼロ転置バックグラウンドが達成されたことを示しました。この高効率でゼロのバックグラウンド転位システムは、標的遺伝子を発現したり、シルクウォームで遺伝子配達ウイルス粒子を生成するために使用される組換えBMNPVを構築するための新しいシンプルで迅速な方法を提供します。
A high efficient way for generation of recombinant Bombyx mori (silkworm) multiple nucleopolyhedrovirus by Tn7-mediated transposition in Escherichia coli was performed. The new system consists of a conditional replication donor vector pRCDM and an attTn7 site blocked E. coli containing BmNPV-Bacmid. The donor vector contains a replication origin derived from R6Kgamma, which propagated only in host cells with pir gene expression decreased in the transposition background greatly. Compared with original vector derived from pUC, the transposition efficiency increased from 5.7 to 66% ( approximately 10 fold) when using conditional replication vector pRCDM transposition into original BmDH10Bac. A further effort to decrease the transposition background was made by blocking the attTn7 site in host E. coli genome. The resulting attTn7 occupied BmDH10BacDeltaTn7 resulted in a significant increase from 5.7 to 23% ( approximately 4 fold) in the efficacy of generate recombinant BmNPV Bacmid by transposition. Furthermore, the transposition of BmDH10BacDeltaTn7 with pRCDM resulted typically in 100% white colonies, and it indicated that a zero transposition background was accomplished. This high efficient and zero background transposition system provides a new simple and rapid method for construction of recombinant BmNPV used to express target genes or produce gene-delivery virus particles in silkworm.
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