第27章反応性酸素種の形成におけるシトクロムBの役割の研究を促進するために、ミトコンドリアシトクロムB遺伝子に点変異を導入する改善された方法

シトクロムBは、シトクロムBC（1）複合体の極めて重要なタンパク質サブユニットであり、一般的に電子が酵素から異常に迂回し、酸素で反応してスーパーオキシドアニオンを形成する主要な部位と考えられる酵素でユビキノール酸化部位を形成します。さらに、最近の研究では、シトクロムBの変異がBC（1）複合体による酸素ラジカル形成の速度を大幅に増加させることができることが示されています。したがって、酸素ラジカル形成におけるシトクロムBの役割をよりよく理解するために、シトクロムB遺伝子の突然変異誘発によってシトクロムBを操作できることが有利です。シトクロムBは真核細胞のミトコンドリアゲノムにエンコードされており、陽性クローンの退屈なスクリーニングプロセスのため、遺伝子への点変異の導入は一般に面倒です。さらに、以前は、酸素ラジカル形成を著しく促進する突然変異に予想されるように、呼吸機能の喪失につながる点変異を導入することは特に困難でした。シトクロムBにアミノ酸の変化をより効率的に導入するために、Saccharomyces cerevisiaeミトコンドリアシトクロムB遺伝子の突然変異誘発の方法を考案しました。この方法では、通常、核DNAによってコードされる遺伝子であるArg8は、天然に存在するミトコンドリアシトクロムB遺伝子に取って代わり、ミトコンドリアゲノム（Arg8（M））から発現するArg8をもたらします。その後、Arg8（M）を変異バージョンのシトクロムBに置き換えると、アルギニン補助栄養素が生じます。呼吸能力のあるシトクロムB変異体は、発酵不可能な基質の成長を回復する能力により、直接選択できます。変異したシトクロムBが非機能的である場合、ミトコンドリア形質転換プラスミド上のCOX2呼吸器遺伝子マーカーの存在により、厳しい呼吸不全（MIT（ - ））を持つシトクロムB変異体のスクリーニングが可能になります。

Cytochrome b is a pivotal protein subunit of the cytochrome bc(1) complex and forms the ubiquinol oxidation site in the enzyme that is generally thought to be the primary site where electrons are aberrantly diverted from the enzyme, reacting with oxygen to form superoxide anion. In addition, recent studies have shown that mutations in cytochrome b can substantially increase rates of oxygen radical formation by the bc(1) complex. It would, thus, be advantageous to be able to manipulate cytochrome b by mutagenesis of the cytochrome b gene to better understand the role of cytochrome b in oxygen radical formation. Cytochrome b is encoded in the mitochondrial genome in eukaryotic cells, and introduction of point mutations into the gene is generally cumbersome because of the tedious screening process for positive clones. In addition, previously it has been especially difficult to introduce point mutations that lead to loss of respiratory function, as might be expected of mutations that markedly enhance oxygen radical formation. To more efficiently introduce amino acid changes into cytochrome b we have devised a method for mutagenesis of the Saccharomyces cerevisiae mitochondrial cytochrome b gene that uses a recoded ARG8 gene as a "placeholder" for the wild-type b gene. In this method ARG8, a gene that is normally encoded by nuclear DNA, replaces the naturally occurring mitochondrial cytochrome b gene, resulting in ARG8 expressed from the mitochondrial genome (ARG8(m)). Subsequently replacing ARG8(m) with mutated versions of cytochrome b results in arginine auxotrophy. Respiratory-competent cytochrome b mutants can be selected directly by virtue of their ability to restore growth on nonfermentable substrates. If the mutated cytochrome b is nonfunctional, the presence of the COX2 respiratory gene marker on the mitochondrial transforming plasmid enables screening for cytochrome b mutants with a stringent respiratory deficiency (mit(-)).