フェルリック - キシレノールオレンジ法による脂質ヒドロペルオキシドの測定（2）リポキシゲナーゼアッセイへの応用

鉄 - キシレノールオレンジ（Fox）法は、560 nmのピーク吸光度を備えた色付きのフェルリック - キシレノールオレンジ（XO/Fe3+）産物を測定することにより、ヒドロペルオキシドの定量化に使用されています。最近、修正されたフォックス法を報告しましたが、その感度は、610 nmのピーク吸光度を持つXO/Fe3+-PC複合体を形成することにより、膜性ホスファチジルコリン（PC）の存在下で増加しました。リポキシゲナーゼ（LOX）とその代謝産物は、広範囲の疾患状態に関係しています。新しく開発されたFoxメソッドを、それぞれ典型的な動物および植物リポキシゲナーゼとして、それぞれヒト15-リポキシゲナーゼ-2（15-Lox-2）および大豆リポキシゲナーゼ（Slox）のアッセイに適用しました。共役ジエンに起因する237 nmのUV-吸収により測定された15-LOX-2で産生される15-LOX-2で産生される15-s-ヒドロペルオキシエイコサ-5,8,10,14-テトラエン酸（15-HPETE）の量は、610 nmでの吸光度を測定するフォックス法。2つの方法で測定された15 HPETEの生産時間コースもよく相関していました。スロックスは、卵黄PC（EYPC）に急速に酸化されていないエステル化リノール酸（LA）とゆっくりとエステル化した脂肪酸をエステル化しました。MeohとTriton X-100によって膜構造が適度に乱れた場合、EYPCの可用性は増加しましたが、La酸化はそれらによって容易に減少しました。これらの結果は、私たちの方法がリポキシゲナーゼアッセイに役立つことを示しています。さらに、私たちの方法は、基質としてLAおよびEYPCを使用したSlox活性に対する5,8,8,11,14-エイコサテトレイ酸（ETYA）の阻害効果をアッセイすることに適用できました。ETYAの阻害用量依存性は、LAおよびEYPCシステムでほぼ同じでしたが、酵素濃度は1,000倍によって異なり、ETYAが競合阻害剤として機能したことを示唆しています。これらの結果は、リポキシゲナーゼの新規阻害剤の同定のためのスクリーニングとして私たちの方法が役立つ可能性があることを示しています。

The ferric-xylenol orange (FOX) method has been used for quantification of hydroperoxides by measuring the colored ferric-xylenol orange (XO/Fe3+) product with a peak absorbance at 560 nm. We recently reported a modified FOX method, the sensitivity of which was increased in the presence of membranous phosphatidylcholine (PC) by forming a XO/Fe3+-PC complex with a peak absorbance at 610 nm. Lipoxygenases (LOXs) and their metabolites have been implicated in a wide range of disease states. We applied our newly developed FOX method to the assay of human 15-lipoxygenase-2 (15-LOX-2) and soybean lipoxygenase (SLOX) as typical animal and plant lipoxygenases, respectively. The amounts of 15-S-hydroperoxyeicosa-5,8,10,14-tetraenoic acid (15-HPETE) produced by 15-LOX-2 measured by UV-absorption at 237 nm attributed to the conjugated diene, coincided with the results of our FOX method measuring absorbance at 610 nm. The 15-HPETE production time courses measured by the two methods also correlated well. SLOX rapidly oxidized unesterified linoleic acids (LA) and slowly esterified fatty acids in egg yolk PC (EYPC). Availability of EYPC was increased if the membrane structure was moderately disturbed by MeOH and Triton X-100, but LA oxidation was readily decreased by them. These results indicate that our method is useful for lipoxygenase assay. Furthermore, our method was applicable to assaying the inhibitory effect of 5,8,11,14-eicosatetraynoic acid (ETYA) on SLOX activity using LA and EYPC as substrates. The inhibition dose-dependency of ETYA was almost the same in the LA and EYPC systems, although the enzyme concentrations differed by a factor of 1,000, suggesting that ETYA functioned as a competitive inhibitor. These results indicate that our method may be useful as a screen for the identification of novel inhibitors of lipoxygenases.