リシンの検出：リシンA鎖リボソーム剥離速度論の敏感な発光アッセイ

リシンは、植物に見られる致死リボソーム不活性化タンパク質（RIP）の家族です。カスタ豆からのリシン毒素A鎖（RTA）は、真核生物rRNAのガガテトラループからの単一塩基の加水分解除去を触媒し、サルシン - リシンループ（SRL）から単一のアデニンを放出します。タンパク質合成は、細胞死をもたらす伸長因子結合部位の喪失によって阻害されます。RTA触媒によるリボソームまたは小さな幹ループRNAから放出されたアデニンの測定のための敏感な結合アッセイを報告します。アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRTase）およびピルビン酸オルソリン酸ジキナーゼ（PPDK）は、ホタルルシフェラーゼによる定量化のためにアデニンをATPに変換します。得られたアンプは、アデニン濃度に比例した持続的な発光を与えるためにATPに循環します。ピコモールサブアデニン定量により、真核生物リボソームに対するRTAの作用が、連続的なハイスループットアッセイで追跡されます。RIP触媒活性の容易な分析では、植物毒素検出、阻害剤スクリーニング、オリゴヌクレオチドおよび無傷のリボソーム上の剥離剤の機構分析、および癌免疫化学療法に適用されます。ウサギ網状赤血球80Sリボソーム上のRTAの触媒作用の速度論的分析は、2.6 x 10（8）m（-1）s（-1）の触媒効率を確立し、大きな反応物でさえ触媒完全性を示す拡散制限された反応を示します。

Ricin is a family member of the lethal ribosome-inactivating proteins (RIP) found in plants. Ricin toxin A-chain (RTA) from castor beans catalyzes the hydrolytic depurination of a single base from a GAGA tetraloop of eukaryotic rRNA to release a single adenine from the sarcin-ricin loop (SRL). Protein synthesis is inhibited by loss of the elongation factor binding site resulting in cell death. We report a sensitive coupled assay for the measurement of adenine released from ribosomes or small stem-loop RNAs by RTA catalysis. Adenine phosphoribosyl transferase (APRTase) and pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) convert adenine to ATP for quantitation by firefly luciferase. The resulting AMP is cycled to ATP to give sustained luminescence proportional to adenine concentration. Subpicomole adenine quantitation permits the action of RTA on eukaryotic ribosomes to be followed in continuous, high-throughput assays. Facile analysis of RIP catalytic activity will have applications in plant toxin detection, inhibitor screens, mechanistic analysis of depurinating agents on oligonucleotides and intact ribosomes, and in cancer immunochemotherapy. Kinetic analysis of the catalytic action of RTA on rabbit reticulocyte 80S ribosomes establishes a catalytic efficiency of 2.6 x 10(8) M(-1) s(-1), a diffusion limited reaction indicating catalytic perfection even with large reactants.