ゼオシンまたはG-418硫酸を主要な選択可能なマーカーとして使用したPichia pastorisベクターを使用したGFPの発現

Pichia Pastorisは、異種タンパク質を発現するための人気のある宿主生物であり、この酵母のさまざまな発現ベクターが現在利用可能です。最近、新規支配的な抗生物質耐性マーカーを含むベクターは、このメチロトロピック酵母株の強力で発達した研究分野になりました。新しいP. pastoris発現ベクター、ppickanmx6、ppickanmx6alphaシリーズを開発しました。これらのベクターは、PPICZA、B、C、およびPPICZALPHAA、B、およびCベクターのゼオシン抵抗遺伝子を、P。418亜硫酸耐性をP.パスリスに付与するPFA6A KANMX6のTN903 KAN（R）マーカーに置き換えることにより構築されました。2つの形質転換酵母株における抗生物質耐性の限界を調査し、選択マーカーは安定して保持されることが示されました。それらの有用性を実証するために、ヘキサヒスチジンタグ付き緑色蛍光タンパク質（GFPH6）をコードする遺伝子を、P。pastoris細胞で調べた新しいベクターの1つとGFP発現の1つにクローン化されました。PPICKANMX6Bベクターを使用したタンパク質発現レベルは、酵母細胞蛍光に見られるゼオシン耐性に基づいて、元のプラスミドを使用したものと同等でした。さらに、GFPH6は、両方の酵母株の溶解物から固定化された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMAC）によって分離することができました。モデルレポーターコンストラクトは、組換えタンパク質発現の成功と、これらの新しいベクターを使用したその後の精製を実証するために使用されています。対応するベクターは、さまざまな異なるプロモーターの制御下で外来遺伝子発現を使用して設計して、異種タンパク質生産のための細胞工場としてのP. pastorisの柔軟性を高めることもできます。

Pichia pastoris is a popular host organism for expressing heterologous proteins, and various expression vectors for this yeast are currently available. Recently, vectors containing novel dominant antibiotic resistance markers have become a strong and developing field of research for this methylotropic yeast strain. We have developed new P. pastoris expression vectors, the pPICKanMX6 and pPICKanMX6alpha series. These vectors were constructed by replacing the zeocin resistance gene of the pPICZA, B, C and pPICZalphaA, B and C vectors with the Tn903 kan(R) marker from pFA6a KanMX6, which confers G-418 sulphate resistance in P. pastoris. The limits of antibiotic resistance in two transformant yeast strains were investigated, and the selection marker was shown to be stably retained. To demonstrate their usefulness, a gene encoding hexa-histidine-tagged green fluorescent protein (GFPH6) was cloned into one of the new vectors and GFP expression examined in P. pastoris cells. The protein expression levels using the pPICKanMX6B vector were comparable with that using the original plasmid, based on zeocin resistance as seen by yeast cell fluorescence. Moreover, GFPH6 was able to be isolated by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) from lysates of both yeast strains. A model reporter construct has been used to demonstrate successful recombinant protein expression and its subsequent purification using these new vectors. Corresponding vectors can now also be engineered with foreign gene expression under the control of various different promoters, to increase the flexibility of P. pastoris as a cellular factory for heterologous protein production.