新規TCF4結合タンパク質であるMAD2Bは、TCF4を介した上皮間葉系変換を調節します

T細胞因子4（TCF4）は、WNTシグナル伝達経路でベータカテニンと相互作用し、癌の進行に関与する下流の標的遺伝子をトランス活性化します。TCF4を介した生物学的応答を調節するタンパク質を特定するために、酵母2ハイブリッドスクリーニングを実行してTCF4結合タンパク質を検索し、MAD2BがTCF4と相互作用することがわかりました。MAD2Bは、共免疫沈降によりTCF4結合タンパク質であることを確認しました。Topflashレポーターアッセイを使用して、MAD2BがTCF4を介したトランス活性化をブロックすることがわかりました。TCF4のMAD2B結合領域は、TCF4欠失マッピングと電気泳動移動シフトアッセイ分析によって特定されました。TCF4とMAD2Bの相互作用は、TCF4のDNA結合能力を廃止しました。SW480結腸直腸癌細胞におけるMAD2Bのノックダウンにより、上皮細胞が間葉系線維芽細胞症の表現型（上皮間葉系透析拡散化）に変換されました。E-カドヘリンプロモーターレポーター分析は、MAD2BがTCF4を介したE-カドヘリン発現を調節することを示しました。MAD2BノックダウンはE-カドヘリン発現をブロックし、N-カドヘリンやビメンチンなどの間葉系マーカーを有意に誘導しました。間葉系誘導には、F-アクチンの再分布と線維芽細胞様の表現型の出現が伴いました。MAD2Bノックダウンは、既知のTCF4誘発E-カドヘリン転写抑制因子であるSLUGのmRNAとタンパク質レベルの両方を増加させました。クロマチン免疫沈降アッセイは、MAD2BサイレンシングがTCF4がスラッグプロモーターに結合する能力を高めることを示しました。したがって、MAD2Bは新規TCF4相互作用タンパク質です。この研究は、TCF4を介した上皮間葉系変換におけるMAD2Bの関与の最初の証拠を提供します。

T cell factor 4 (TCF4) interacts with beta-catenin in the WNT signaling pathway and transactivates downstream target genes involved in cancer progression. To identify proteins that regulate TCF4-mediated biological responses, we performed a yeast two-hybrid screen to search for a TCF4-binding protein(s) and found that MAD2B interacts with TCF4. We confirmed that MAD2B is a TCF4-binding protein by co-immunoprecipitation. Using the TOPFLASH reporter assay, we found that MAD2B blocks TCF4-mediated transactivation. The MAD2B binding regions of TCF4 were identified by TCF4 deletion mapping and electrophoretic mobility shift assay analysis. TCF4 and MAD2B interactions abolished the DNA binding ability of TCF4. Knockdown of MAD2B in SW480 colorectal cancer cells led to the conversion of epithelial cells to a mesenchymal fibroblastoid phenotype (epithelial-mesenchymal transdifferentiation). An E-cadherin promoter reporter analysis showed that MAD2B modulates TCF4-mediated E-cadherin expression. MAD2B knockdown blocked E-cadherin expression and significantly induced mesenchymal markers, such as N-cadherin and vimentin. Mesenchymal induction was accompanied by F-actin redistribution and the appearance of a fibroblastoid phenotype. MAD2B knockdown also increased both mRNA and protein levels of Slug, a known TCF4-induced E-cadherin transcriptional repressor. A chromatin immunoprecipitation assay showed that MAD2B silencing enhances the ability of TCF4 to bind the Slug promoter. Thus, MAD2B is a novel TCF4-interacting protein. This study provides the first evidence for the involvement of MAD2B in TCF4-mediated epithelial-mesenchymal transdifferentiation.