テオフィリンとカフェインの代謝のための2つの異なる経路は、Pseudomonas putida CBB5で共発現しています

Pseudomonas Putida CBB5は、カフェインを濃縮することにより土壌から分離されました。この株は、カフェイン、セオブロミン、パラキサンチン、および7-メチルキサンチンだけでなく、唯一の炭素および窒素源としてだけでなく、テオフィリンと3-メチルキサンチンも使用しました。使用済みの培地および安静時の細胞懸濁液における代謝物の分析により、CBB5は最初に1メチルキサンチンと3メチルキサンチンへのこれまで報告されていない経路を介してテオフィリンを脱メチル化したことが確認されました。テオフィリンと3-メチルキサンチンへのテオフィリンのH依存性変換は、テオフィリン栽培CBB5の粗細胞抽出物でも検出されました。1-メチルキサンチンと3-メチルキサンチンは、その後、キサンチンにdemethylatedをn脱メチル化しました。CBB5は、それぞれ1,3-ジメチル尿酸と1-および3-メチル尿酸に酸化したテオフィリンと1-メチルキサンチンも酸化しました。ただし、これらのメチル酸はそれ以上代謝されませんでした。これらのメチル尿酸の形成の原因は、広範囲に及ぶキサンチン酸化酵素が原因でした。対照的に、CBB5はカフェインをテオブロミン（主要代謝産物）およびパラキサンチン（マイナー代謝物）に代謝しました。これらのジメチルキサンチンは、さらに7-メチルキサンチンを介してキサンチンに脱メチル化されました。テオブロミン、パラキサンチン、および7-メチルキサンチン栽培細胞も、同じ経路を介して上記のすべてのメチルキサンチンを代謝しました。したがって、テオフィリンとカフェインN-demethylation経路は、異なるメチルキサンチン中間体を介してキサンチンに収束しました。キサンチンは最終的に尿酸に酸化されました。テオフィリンとカフェイン分解に関与する酵素は、CBB5がテオフィリンまたはカフェインまたはその代謝物で成長したときに共発現しました。しかし、3-メチルキサンチン栽培CBB5細胞はカフェインを代謝しませんでしたが、テオフィリンはメチル酸のみのレベルで大幅に減少したレベルで代謝されました。私たちの知る限り、これは、カフェインの異なる経路と細菌におけるテオフィリン分解のテオフィリンN脱メチル化と共発現の最初の報告です。

Pseudomonas putida CBB5 was isolated from soil by enrichment on caffeine. This strain used not only caffeine, theobromine, paraxanthine, and 7-methylxanthine as sole carbon and nitrogen sources but also theophylline and 3-methylxanthine. Analyses of metabolites in spent media and resting cell suspensions confirmed that CBB5 initially N demethylated theophylline via a hitherto unreported pathway to 1- and 3-methylxanthines. NAD(P)H-dependent conversion of theophylline to 1- and 3-methylxanthines was also detected in the crude cell extracts of theophylline-grown CBB5. 1-Methylxanthine and 3-methylxanthine were subsequently N demethylated to xanthine. CBB5 also oxidized theophylline and 1- and 3-methylxanthines to 1,3-dimethyluric acid and 1- and 3-methyluric acids, respectively. However, these methyluric acids were not metabolized further. A broad-substrate-range xanthine-oxidizing enzyme was responsible for the formation of these methyluric acids. In contrast, CBB5 metabolized caffeine to theobromine (major metabolite) and paraxanthine (minor metabolite). These dimethylxanthines were further N demethylated to xanthine via 7-methylxanthine. Theobromine-, paraxanthine-, and 7-methylxanthine-grown cells also metabolized all of the methylxanthines mentioned above via the same pathway. Thus, the theophylline and caffeine N-demethylation pathways converged at xanthine via different methylxanthine intermediates. Xanthine was eventually oxidized to uric acid. Enzymes involved in theophylline and caffeine degradation were coexpressed when CBB5 was grown on theophylline or on caffeine or its metabolites. However, 3-methylxanthine-grown CBB5 cells did not metabolize caffeine, whereas theophylline was metabolized at much reduced levels to only methyluric acids. To our knowledge, this is the first report of theophylline N demethylation and coexpression of distinct pathways for caffeine and theophylline degradation in bacteria.