多次元液体クロマトグラフィータンデム質量分析ショットガンプロテオミクス分析におけるホルマリン固定パラフィン包埋および凍結組織から得られたタンパク質在庫の等価

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織標本は、レトロスペクティブバイオマーカー発見研究のための潜在的に価値のあるリソースを構成し、最近の研究は、Shotgunプロテオミクスを使用してFFPE組織タンパク質を特徴付ける実現可能性を示しています。この分野の重要な問題は、FFPE標本で特徴付けられるプロテオームが、対応する新鮮または凍結組織標本のプロテオームと同等であるかどうかです。ここでは、同じ結腸腺組織から調製された凍結およびFFPE標本のショットガンプロテオーム解析を比較しました。軽度の条件下での脱パラフィン、再水和、およびトリプティック消化後、200マイクログのタンパク質に対応するFFPE標本は、1次元逆相液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）分析で約400の自信のあるタンパク質同定をもたらしました。凍結プロテオームとFFPEプロテオームの主な違いは、観察されたアルギニンC末端ペプチドに対するリジンC末端の割合の減少でしたが、これらの違いは同定されたタンパク質にほとんど影響しませんでした。ホルムアルデヒド化学に起因する共有結合ペプチド修飾は、MS/MSデータセットの分析によって検出されませんでした。中性緩衝ホルマリンで最大2日間組織の固定は、タンパク質の同定に悪影響を与えませんでした。アーカイブ結腸腺腫FFPE標本の分析は、1、3、5、および10年の間蓄積された標本からのMS/MSスペクトル数の同等数とタンパク質グループの同定を示しました。逆位相LC-MS/MSとのペプチド等電気焦点ベースの分離の組み合わせは、凍結組織から600 ngのタンパク質とFFPE組織からの2302タンパク質グループの2554タンパク質グループを同定し、少なくとも2つの異なるペプチド同定をタンパク質ごとに同定しました。凍結された凍結とFFPEの複合データの分析により、特定されたタンパク質グループで92％の重複が示されました。同定されたタンパク質の遺伝子オントロジーカテゴリの比較では、細胞内局在に基づくタンパク質同定にバイアスがないことが明らかになりました。この研究では、翻訳後修飾の状態は調べられませんでしたが、アーカイブサンプルは、メチオニン酸化のわずかな増加を示しました。これらのデータは、FFPEおよび凍結組織標本から得られたプロテオームインベントリの等価性を示し、バイオマーカー発見のためのFFPE組織の遡及的プロテオーム解析をサポートします。

Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens comprise a potentially valuable resource for retrospective biomarker discovery studies, and recent work indicates the feasibility of using shotgun proteomics to characterize FFPE tissue proteins. A critical question in the field is whether proteomes characterized in FFPE specimens are equivalent to proteomes in corresponding fresh or frozen tissue specimens. Here we compared shotgun proteomic analyses of frozen and FFPE specimens prepared from the same colon adenoma tissues. Following deparaffinization, rehydration, and tryptic digestion under mild conditions, FFPE specimens corresponding to 200 microg of protein yielded approximately 400 confident protein identifications in a one-dimensional reverse phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. The major difference between frozen and FFPE proteomes was a decrease in the proportions of lysine C-terminal to arginine C-terminal peptides observed, but these differences had little effect on the proteins identified. No covalent peptide modifications attributable to formaldehyde chemistry were detected by analyses of the MS/MS datasets, which suggests that undetected, cross-linked peptides comprise the major class of modifications in FFPE tissues. Fixation of tissue for up to 2 days in neutral buffered formalin did not adversely impact protein identifications. Analysis of archival colon adenoma FFPE specimens indicated equivalent numbers of MS/MS spectral counts and protein group identifications from specimens stored for 1, 3, 5, and 10 years. Combination of peptide isoelectric focusing-based separation with reverse phase LC-MS/MS identified 2554 protein groups in 600 ng of protein from frozen tissue and 2302 protein groups from FFPE tissue with at least two distinct peptide identifications per protein. Analysis of the combined frozen and FFPE data showed a 92% overlap in the protein groups identified. Comparison of gene ontology categories of identified proteins revealed no bias in protein identification based on subcellular localization. Although the status of posttranslational modifications was not examined in this study, archival samples displayed a modest increase in methionine oxidation, from approximately 17% after one year of storage to approximately 25% after 10 years. These data demonstrate the equivalence of proteome inventories obtained from FFPE and frozen tissue specimens and provide support for retrospective proteomic analysis of FFPE tissues for biomarker discovery.