タンパク質のジスルフィド含有量の直接的な分析：シスチン含有タンパク質の安定性と再展開プロセスを監視する方法

これまでのところ、タンパク質のシスチン（ジスルフィド）含有量は、間接的な方法によって日常的に決定されてきました。つまり、シスチンは最初に分析前により安定したハーフシスチンに変換されます。シスチンの含有量を、低ピコモールからフェムトモールレベルで直接かつ正確に分析できることを実証する研究を提示します。この方法には、（a）シスチンの定量的回復を可能にするサンプル加水分解中の真空の採用と、（b）その後HPLCによって分析される安定したダブシスタインを生成する塩化物前術後誘導体化法が含まれます。シスチン残基の直接分析は、タンパク質研究の多くの領域で重要です。単一の分析により、スルフヒドリル（システイン、S-カルボキシメチル誘導体として）とジスルフィド（シスチン）含有量の同時測定が可能になります。この手法は、完全に還元されたシスチン含有タンパク質の再展開プロセスに従うために使用できます。シスチン含有量の直接的な分析は、アルカリ性pHおよび熱処理によって引き起こされるシスチン含有タンパク質の不活性化の程度を監視するのにも役立ちます。タンパク質の不活性化のこのモードでは、シスチンは選択的に破壊され、ランチオニンとリシノアラニンに変換されます。シスチンの減少とランチオニンとリジノアラニンの回収率の両方は、提案された方法によって同時に評価できます。これらのアプリケーションの例をここに示します。

So far, the cystine (disulfide) content of proteins has been routinely determined by indirect methods, i.e., cystines are first converted to more stable half-cystines prior to analysis. We present a study which demonstrates that the cystine content can be directly and accurately analyzed at low picomole to femtomole levels. The method involves (a) the employment of a vacuum during sample hydrolysis which permits quantitative recovery of cystine, and (b) the dabsyl chloride precolumn derivatization method which yields stable DABS-cystine that is subsequently analyzed by HPLC. Direct analysis of the cystine residue is important in numerous areas of protein research. It allows, by a single analysis, simultaneous determination of the sulfhydryl (cysteine, as S-carboxymethyl derivative) and disulfide (cystine) contents. The technique can be used to follow the refolding process of fully reduced, cystine-containing proteins. Direct analysis of the cystine content also serves to monitor the extent of inactivation of cystine-containing proteins caused by alkaline pH and heat treatments. In this mode of protein inactivation, cystines are selectively destroyed and converted to lanthionine and lysinoalanine. Both the decrease of cystine and the recoveries of lanthionine and lysinoalanine can be simultaneously evaluated by the proposed method. Examples of these applications are presented here.