IPTG誘導性アンチセンス発現を使用して、マイコバクテリアにおける細菌性および細菌の標的を描写する

新しい高価値の高い抗菌標的を特定するために、標的酵素の不活性化が細菌の死または停滞につながるかどうかを描写することが望ましい。この知識は、生存可能な抗結核剤のほとんどが細菌性であるマイコバクテリアのような成長のゆっくりとした生物で特に重要です。細胞数が比較的高い標的遺伝子の条件付き欠失または不活性化を通じて、細菌の生存の時間経過に続いて、細菌の標的を識別できます。遺伝子の条件付き不活性化を実行するための簡単なプロトコルは、アンチセンス発現によるものです。マイコバクテリア特異的なIPTG誘導ベクターシステムを開発し、生存速度論に従うことにより、マイコバクテリアにおけるいくつかの既知の必須遺伝子のアンチセンス阻害の効果を監視しました。この方法により、ダウン調節が細菌性または細菌性効果につながる遺伝子を区別できます。イソニアジド用のinha、rpob、c for rifampicin、およびflalloquinolonesのgyr a/bなどの標準的な抗結核薬の標的は、細菌性であることが示されました。対照的に、FTSZのようなターゲットは、細菌性態度で動作しました。embbおよびリボソームRNA遺伝子におけるアンチセンス発現の誘導、viz。、rpljおよびrpslは、わずかな成長阻害のみを示しました。アンチセンス阻害の特異性は、聴覚栄養遺伝子ILVBの場合に最終的に示されました。ILVBのアンチセンス発現後の細菌性活性は、成長媒体にイソロイシン、ロイシン、バリン、パントテン酸を補充したときに完全に逆転しました。さらに、これらの条件下では、分岐鎖アミノ酸経路におけるいくつかの遺伝子の発現が著しく抑制され、標的遺伝子の不活性化が示されました。

In order to identify novel high value antibacterial targets it is desirable to delineate whether the inactivation of the target enzyme will lead to bacterial death or stasis. This knowledge is particularly important in slow growing organisms, like mycobacteria, where most of the viable anti-tubercular agents are bactericidal. A bactericidal target can be identified through the conditional deletion or inactivation of the target gene at a relatively high cell number and subsequently following the time course of survival for the bacteria. A simple protocol to execute conditional inactivation of a gene is by antisense expression. We have developed a mycobacteria specific IPTG inducible vector system and monitored the effect of antisense inhibition of several known essential genes in mycobacteria by following their survival kinetics. By this method, we could differentiate between genes whose down regulation lead to bacteriostatic or bactericidal effect. Targets for standard anti-tubercular drugs like inhA for isoniazid, rpoB and C for rifampicin, and gyr A/B for flouroquinolones were shown to be bactericidal. In contrast targets like FtsZ behaved in a bacteriostatic manner. Induction of antisense expression in embB and ribosomal RNA genes, viz., rplJ and rpsL showed only a marginal growth inhibition. The specificity of the antisense inhibition was conclusively shown in the case of auxotrophic gene ilvB. The bactericidal activity following antisense expression of ilvB was completely reversed when the growth media was supplemented with the isoleucine, leucine, valine and pantothenate. Additionally, under these conditions the expression of several genes in branched chain amino acid pathway was severely suppressed indicating targeted gene inactivation.