チキンHS4絶縁体による導入遺伝子媒介挿入転写活性化の抑制の遺伝子特異性

挿入変異誘発は、ゲノムにランダムに統合するベクターに基づく遺伝子治療の主要な障害として浮上しています。ゲノムウイルス統合の遺伝毒性を減らすことは、最初の近似では、少なくともグロビン遺伝子などの知覚原性の可能性がない治療的ペイロードの場合、癌遺伝子の活性化のリスクを減らすことと同一視することができます。癌遺伝子の活性化の問題に対する魅力的な解決策は、ウイルスベクターに絶縁体/エンハンサーブロッカーを含めることです。この研究では、リコンビナーゼ媒介カセット交換を使用して、チキンHS4およびStil、TAL1およびMAP17の近くに挿入された他の3つの推定絶縁体の存在下または非存在下でのグロビン治療カセットの統合の効果を特徴付けました。SCL/TAL1遺伝子座の癌遺伝子。遺伝子座コントロール領域駆動型グロビントリピューティクスグロビン導入物の挿入が、2つの最も近い遺伝子であるTAL1とMAP17に劇的な活性化効果があり、STILにわずかな効果があり、非発現遺伝子であるCYP4X1に効果がないことを示しています。テストした4つの要素のうち、CHS4は、この導入遺伝子媒介挿入転写活性化を抑制できる唯一のものでした。CHS4は、MAP17の活性化発現に強い抑制効果をもたらしましたが、TAL1の発現にほとんどまたはまったく影響しません。したがって、CHS4の抑制活性はプロモーター特異的です。重要なことに、MAP17の活性化に対するCHS4の観察された抑制効果は、LCRとMAP 17プロモーターとの間の挿入に依存しなかったことです。むしろ、導入遺伝子内のどこでもCHS4の1つまたは2つのコピーの存在は、MAP17の活性化をほぼ完全にブロックするのに十分でした。したがって、この複雑な遺伝子座では、CHS4による導入遺伝子媒介挿入転写活性化の抑制は、CHS4がエンハンサーとプロモーターの間の挿入を必要とするエンハンサーブロッキング活性を介してのみ発現を抑制できると予測するモデルによって適切に説明できませんでした。これは、遺伝子治療ベクターに対するCHS4の挿入の可能性のある効果の理論的理解に重要な意味を持っています。また、CHS4がグロビン導入遺伝子の発現レベルを低下させたことも示しています。したがって、挿入遺伝子の活性化を部分的に防ぐことの利点は、導入遺伝子の発現レベルの低下によって部分的に無効になります。遺伝子治療ベクターへの絶縁体の取り込みの有用性のコスト/利益分析には、治療遺伝子と隣接遺伝子の両方に対する絶縁体の効果が多数の統合部位で決定されるさらなる研究が必要です。プロモーターの特異性を最小限に抑える絶縁体の識別も非常に価値があります。

Insertional mutagenesis has emerged as a major obstacle for gene therapy based on vectors that integrate randomly in the genome. Reducing the genotoxicity of genomic viral integration can, in first approximation, be equated with reducing the risk of oncogene activation, at least in the case of therapeutic payloads that have no known oncogenic potential, such as the globin genes. An attractive solution to the problem of oncogene activation is the inclusion of insulators/enhancer-blockers in the viral vectors. In this study we have used Recombinase-Mediated Cassette Exchange to characterize the effect of integration of globin therapeutic cassettes in the presence or absence of the chicken HS4 and three other putative insulators inserted near Stil, Tal1 and MAP17, three well-known cellular proto-oncogenes in the SCL/Tal1 locus. We show that insertion of a Locus Control Region-driven globin therapeutic globin transgene had a dramatic activating effect on Tal1 and Map17, the two closest genes, a minor effect on Stil, and no effect on Cyp4x1, a non-expressed gene. Of the four element tested, cHS4 was the only one that was able to suppress this transgene-mediated insertional transcriptional activation. cHS4 had a strong suppressive effect on the activation expression of Map17 but has little or no effect on expression of Tal1. The suppressive activity of cHS4 is therefore promoter specific. Importantly, the observed suppressive effect of cHS4 on Map17 activation did not depend on its intercalation between the LCR and the Map 17 promoter. Rather, presence of one or two copies of cHS4 anywhere within the transgene was sufficient to almost completely block the activation of Map17. Therefore, at this complex locus, suppression of transgene-mediated insertional transcriptional activation by cHS4 could not be adequately explained by models that predict that cHS4 can only suppress expression through an enhancer-blocking activity that requires intercalation between an enhancer and a promoter. This has important implications for our theoretical understanding of the possible effects of the insertion of cHS4 on gene therapy vectors. We also show that cHS4 decreased the level of expression of the globin transgene. Therefore, the benefits of partially preventing insertional gene activation are in part negated by the lower expression level of the transgene. A cost/benefit analysis of the utility of incorporation of insulators in gene therapy vectors will require further studies in which the effects of insulators on both the therapeutic gene and the flanking genes are determined at a large number of integration sites. Identification of insulators with minimal promoter specificity would also be of great value.