Dunaliella viridisからの2つの新規葉緑体グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼのクローニングと特性評価

単細胞緑の藻類であるDunaliellaは、高濃度の細胞内グリセロールを互換性のある溶質として蓄積することにより、劇的な浸透圧ストレスを生き残るための異常な能力を持っています。葉緑体グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）は、ダナリエラの浸透圧調節のためにグリセロールを生成する重要な酵素であると考えられています。この研究では、それぞれ695と701のアミノ酸の2つのポリペプチドをコードするDunaliella viridisの2つの最も顕著なGPDH cDNA（DVGPDH1およびDVGPDH2）をクローン化しました。高等植物GPDHとは異なり、両方のタンパク質には、C末端GPDHドメインに加えて、N末端に余分なホスホセリンホスファターゼ（SERB）ドメインが含まれていました。このような二領域GPDHは、新しいタイプのGPDHを表しており、クロロフィテ系統にのみ見られます。タバコ葉細胞におけるEGFP融合タンパク質の一時的な発現は、DVGPDH1とDVGPDH2の両方が葉緑体に局在していることを示しました。DVGPDH1またはDVGPDH2の過剰発現は、酵母GPDH変異体（GPD1DELTA）を補完する可能性がありますが、酵母SERB変異体（Ser2delta）は補完できませんでした。精製されたDVGPDH1およびDVGPDH2を使用したin vitroアッセイも両方で見かけのGPDH活性を示しましたが、SERB活性は検出されませんでした。驚くべきことに、植物からの葉緑体GPDHとは異なり、DVGPDH1とDVGPDH2は、NADHとNADPHの両方をCoenzymesとして利用し、NADHを補酵素として使用したときに有意に高いGPDH活性を示しました。Q-PCR分析により、両方の遺伝子が過敏性ショック時に遺伝子発現の一時的な転写誘導を示し、それに続いて遺伝子発現の負のフィードバックが示されたことが明らかになりました。これらの結果は、ダナリエラの塩ストレス中のグリセロール合成の調節に光を当てました。

Dunaliella, a unicellular green alga, has the unusual ability to survive dramatic osmotic stress by accumulating high concentrations of intracellular glycerol as a compatible solute. The chloroplastic glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) has been considered to be the key enzyme that produces glycerol for osmoregulation in Dunaliella. In this study, we cloned the two most prominent GPDH cDNAs (DvGPDH1 and DvGPDH2) from Dunaliella viridis, which encode two polypeptides of 695 and 701 amino acids, respectively. Unlike higher plant GPDHs, both proteins contained extra phosphoserine phosphatase (SerB) domains at their N-termini in addition to C-terminal GPDH domains. Such bi-domain GPDHs represent a novel type of GPDH and are found exclusively in the chlorophyte lineage. Transient expression of EGFP fusion proteins in tobacco leaf cells demonstrated that both DvGPDH1 and DvGPDH2 are localized in the chloroplast. Overexpression of DvGPDH1 or DvGPDH2 could complement a yeast GPDH mutant (gpd1Delta), but not a yeast SerB mutant (ser2Delta). In vitro assays with purified DvGPDH1 and DvGPDH2 also showed apparent GPDH activity for both, but no SerB activity was detected. Surprisingly, unlike chloroplastic GPDHs from plants, DvGPDH1 and DvGPDH2 could utilize both NADH and NADPH as coenzymes and exhibited significantly higher GPDH activities when NADH was used as the coenzyme. Q-PCR analysis revealed that both genes exhibited transient transcriptional induction of gene expression upon hypersalinity shock, followed by a negative feedback of gene expression. These results shed light on the regulation of glycerol synthesis during salt stress in Dunaliella.