ハーバスピリルムセロペディカニファ活動における保存されたシステイン残基の役割

Herbaspirillum seropedicaeは、経済的に重要な作物と関連する内生性陽子栄養性細菌です。H. seropedicaeのNIF遺伝子の転写活性化因子であるNIFAタンパク質は、NIFプロモーターに結合し、RNAポリメラーゼシグマ（54）ホロエンザイムとともに、開いた複合体の形成を触媒して転写開始を可能にします。H. seropedicae nifaの活性は、アンモニウムと酸素レベルによって制御されますが、そのような制御のメカニズムは不明です。酸素感受性は、中央AAA+ドメインにまたがるNIFAのシステイン残基の保存されたモチーフと、AAA+ドメインをC末端DNA結合ドメインに接続するドメイン間リンカーに起因します。ここでは、この保存されたシステインのモチーフを変異化し、in vivoでの変異タンパク質の活性を分析しました。また、NIFAの変異体変異体を精製し、NIFBプロモーター領域に結合する能力をテストしました。酸素感受性タンパク質であるH. seropedicae nifaの間のキメラタンパク質と、酸素耐性タンパク質であるAzotobacter vinelandii Nifaが構築され、酸素反応が中央AAA+およびC末端DNAバインディングドメインによって付与されることを示しました。ニファ。単一のシステインからセリンへの変異体は結合DNAの有能であるが、保存されたシステインモチーフはNIFA活性に不可欠であると結論付けています。

Herbaspirillum seropedicae is an endophytic diazotrophic bacterium that associates with economically important crops. NifA protein, the transcriptional activator of nif genes in H. seropedicae, binds to nif promoters and, together with RNA polymerase-sigma(54) holoenzyme, catalyzes the formation of open complexes to allow transcription initiation. The activity of H. seropedicae NifA is controlled by ammonium and oxygen levels, but the mechanisms of such control are unknown. Oxygen sensitivity is attributed to a conserved motif of cysteine residues in NifA that spans the central AAA+ domain and the interdomain linker that connects the AAA+ domain to the C-terminal DNA binding domain. Here we mutagenized this conserved motif of cysteines and assayed the activity of mutant proteins in vivo. We also purified the mutant variants of NifA and tested their capacity to bind to the nifB promoter region. Chimeric proteins between H. seropedicae NifA, an oxygen-sensitive protein, and Azotobacter vinelandii NifA, an oxygen-tolerant protein, were constructed and showed that the oxygen response is conferred by the central AAA+ and C-terminal DNA binding domains of H. seropedicae NifA. We conclude that the conserved cysteine motif is essential for NifA activity, although single cysteine-to-serine mutants are still competent at binding DNA.