内因性ドナーとしてのトリプトファン残基を伴うフェルスターレゾナンスエネルギー移動を介したタンパク質の均一な非競争アッセイおよびアクセプターとしての蛍光リガンド

Förster-Resonance-Energy-Transfer（FRET）に基づいた生物サンプル中のタンパク質の均一な非競争アッセイは、そのトリプトファン残基を固有のドナーとして使用し、分析的FRETプロブとして定義されたFRETアクセプターとして特定の蛍光リガンドを使用して提案されました。適切なフルオロフォアのコンジュゲート。これは、340 nm前後の励起ピークを持つはずですが、目的のタンパク質に結合する部分がある励起渓谷は、タンパク質に分析的なFRETプローブを与えました。この方法をテストするために、N-ビオチニル-N ' - （1-ナフチル） - エチレンジアミン（BNEDA）を、ストレプトアビジン（SAV）の均一な非競合アッセイの分析的なFRETプローブとして使用しました。結合したBnedaとトリプトファンの残基間のFRETの発生は、複合体のモデル化されたジオメトリによって支持されました。280 nmでの励起により、遊離Bneは430 nmで無視できる蛍光を生成しましたが、結合したBnedaは、2分間の結合反応後、430 nmではるかに高い安定蛍光を生成しました。Bnedaとビオチンの間の競合結合により、Bneda（n = 3）の（16 +/- 3）FMの解離定数が得られました。280 nmでの励起により、32.0 nm Bnedaを含む430 nmの反応混合物での蛍光が直線的に応答し、0.40〜30.0 nmのサブユニット濃度を保存し、生物学的サンプルの一般的な干渉に対する望ましい耐性を節約しました。したがって、関心のあるタンパク質でトリプトファン残基を内因性ドナーとして使用し、対応するFRETアクセプターとしてその蛍光リガンドを使用することにより、生物学的サンプルにおけるタンパク質のこの均質な非競合アッセイは効果的で有利でした。

Homogeneous noncompetitive assay of a protein in biological samples based on Förster-resonance-energy-transfer (FRET) was proposed by using its tryptophan residues as intrinsic donors and its specific fluorescent ligand as the FRET acceptor that was defined as an analytical FRET probe. Conjugate of a suitable fluorophore, which should have an excitation peak around 340 nm but an excitation valley around 280 nm, with a moiety binding to a protein of interest gave an analytical FRET probe to the protein. To test this method, N-biotinyl-N'-(1-naphthyl)-ethylenediamine (BNEDA) was used as an analytical FRET probe for homogeneous noncompetitive assay of streptavidin (SAV). The occurrence of FRET between the bound BNEDA and tryptophan residues was supported by the modeled geometry of the complex. By excitation at 280 nm, free BNEDA produced negligible fluorescence at 430 nm, but the bound BNEDA produced much higher stable fluorescence at 430 nm after 2 min of binding reaction. The competitive binding between BNEDA and biotin gave the dissociation constant of (16+/-3) fM for BNEDA (n=3). By excitation at 280 nm, fluorescence at 430 nm of reaction mixtures containing 32.0 nM BNEDA responded linearly to SAV subunit concentrations ranging from 0.40 to 30.0 nM with the desirable resistance to common interferences in biological samples. Therefore, by using tryptophan residue(s) in a protein of interest as intrinsic donor(s) and its fluorescent ligand as the corresponding FRET acceptor, this homogeneous noncompetitive assay of the protein in biological samples was effective and advantageous.