内皮皮膚酸化酸化物合成酵素カップリングの調節におけるジヒドロ葉酸還元酵素によるテトラヒドロビオプテリンリサイクルの重要な役割：de novoバイオプテリン合成とサルベージ経路の相対的な重要性

テトラヒロヒョプテリン（BH4）は、内皮酸化酸化物シンターゼ（ENOS）による一酸化窒素の合成に必要な補因子であり、内皮内のBH4バイオアベイラビリティは、ENOS（ENOS Coupling）によるNOとスーパーオキシドの産生のバランスを調節する上で重要な要因です。BH4レベルは、de novo BH4生合成における速度制限酵素であるGTPシクロヒドラーゼI（GTPCH）の活性によって決定されます。ただし、BH4レベルは酸化の影響を受ける可能性があり、7,8-ジヒドロビオプテリン（BH2）を形成し、ENOSの分配を促進します。逆に、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）はBH2からBH4を再生できますが、ENOS結合を維持する上でのDHFRの機能的重要性は不明のままです。内皮細胞のBH4対BH2レベルの調節およびTET調節GTPCH発現と組み合わせたENOSを発現する細胞株の調節におけるDHFRの役割を調査して、低レベルまたは高レベルのDE NOVO BH4生合成の効果を比較しました。メトトレキサートによるDHFR活性の薬理学的阻害またはRNA干渉によるDHFRタンパク質の遺伝的ノックダウンは、細胞内BH4を減少させ、BH2レベルを増加させ、ENOS依存性スーパーオキシドの増加によって示されるがNO産生の減少によって示されるENOSの酵素的脱共役をもたらしました。DHFRノックダウンによって誘導されるBH4：BH2比の減少とは対照的に、GTPCHノックダウンは総ビオプテリンレベルを大幅に低下させましたが、BH4：BH2比は変化しませんでした。低いバイオプテリンレベルのeNOSを発現する細胞では、DHFR阻害またはノックダウンがBH4：BH2比をさらに減少させ、ENOS分離を悪化させました。まとめると、これらのデータは、特に総バイオプテリンの可用性が低い状態で、BH4：BH2比を維持することにより、ENOS結合におけるDHFRの重要な役割を明らかにしています。

Tetrahyrobiopterin (BH4) is a required cofactor for the synthesis of nitric oxide by endothelial nitric-oxide synthase (eNOS), and BH4 bioavailability within the endothelium is a critical factor in regulating the balance between NO and superoxide production by eNOS (eNOS coupling). BH4 levels are determined by the activity of GTP cyclohydrolase I (GTPCH), the rate-limiting enzyme in de novo BH4 biosynthesis. However, BH4 levels may also be influenced by oxidation, forming 7,8-dihydrobiopterin (BH2), which promotes eNOS uncoupling. Conversely, dihydrofolate reductase (DHFR) can regenerate BH4 from BH2, but the functional importance of DHFR in maintaining eNOS coupling remains unclear. We investigated the role of DHFR in regulating BH4 versus BH2 levels in endothelial cells and in cell lines expressing eNOS combined with tet-regulated GTPCH expression in order to compare the effects of low or high levels of de novo BH4 biosynthesis. Pharmacological inhibition of DHFR activity by methotrexate or genetic knockdown of DHFR protein by RNA interference reduced intracellular BH4 and increased BH2 levels resulting in enzymatic uncoupling of eNOS, as indicated by increased eNOS-dependent superoxide but reduced NO production. In contrast to the decreased BH4:BH2 ratio induced by DHFR knockdown, GTPCH knockdown greatly reduced total biopterin levels but with no change in BH4:BH2 ratio. In cells expressing eNOS with low biopterin levels, DHFR inhibition or knockdown further diminished the BH4:BH2 ratio and exacerbated eNOS uncoupling. Taken together, these data reveal a key role for DHFR in eNOS coupling by maintaining the BH4:BH2 ratio, particularly in conditions of low total biopterin availability.