Engineering BSPQI Nicking酵素とDNA標識におけるNBSPQIの応用と一本鎖DNAの産生

BSPQIは、認識シーケンス5'GCTCTTC N1/N4 3 'を備えたサーモスタブルタイプIIS制限エンドヌクレアーゼ（REASE）です。ここでは、大腸菌におけるBSPQI制限酵素のBSPQIR遺伝子のクローニングと発現を報告します。BSPQI帯電した残基のアラニンスキャンにより、多くのDNAニッキングバリアントが特定されました。さまざまなアミノ酸置換の組み合わせをサンプリングした後、主に最高鎖DNAニッキング活性でNT.BSPQIトリプル変異体（E172A/E248A/E255K）を構築しました。さらに、BSPQIのトリプル変異体（NB.BSPQI、N235A/K331A/R428A）を設計して、底部鎖ニッキング酵素を作成しました。さらに、単一のDNA分子の光学マッピングにNt.BSPQIの適用を実証しました。NTまたはNB.BSPQI-NICKED DSDNAは、大腸菌エキソヌクレアーゼIIIによってさらに消化して、ダウンストリームアプリケーション用のSSDNAを作成できます。BSPQIには、2つの潜在的な触媒部位が含まれています。HNHエンドヌクレアーゼファミリーに見られるD-H-N-Kモチーフを備えた最高鎖触媒部位（CT）と、3つの散乱GLU残基を持つ底鎖触媒部位（CB）です。GenBankのタンパク質のBLASTP分析は、配列決定された細菌ゲノムCroceibacter Atlanticus HTCC2559からBSPQIに対して有意なアミノ酸配列同一性を持つ推定制限酵素を示しました。この制限遺伝子はPCRによって増幅され、T7発現ベクターにクローン化されました。部分精製酵素からの消化産物の制限マッピングおよび流出DNAシーケンスは、それが6-bp認識を持つEARIイソスキゾマーであることを示しました。

BspQI is a thermostable Type IIS restriction endonuclease (REase) with the recognition sequence 5'GCTCTTC N1/N4 3'. Here we report the cloning and expression of the bspQIR gene for the BspQI restriction enzyme in Escherichia coli. Alanine scanning of the BspQI charged residues identified a number of DNA nicking variants. After sampling combinations of different amino acid substitutions, an Nt.BspQI triple mutant (E172A/E248A/E255K) was constructed with predominantly top-strand DNA nicking activity. Furthermore, a triple mutant of BspQI (Nb.BspQI, N235A/K331A/R428A) was engineered to create a bottom-strand nicking enzyme. In addition, we demonstrated the application of Nt.BspQI in optical mapping of single DNA molecules. Nt or Nb.BspQI-nicked dsDNA can be further digested by E. coli exonuclease III to create ssDNA for downstream applications. BspQI contains two potential catalytic sites: a top-strand catalytic site (Ct) with a D-H-N-K motif found in the HNH endonuclease family and a bottom-strand catalytic site (Cb) with three scattered Glu residues. BlastP analysis of proteins in GenBank indicated a putative restriction enzyme with significant amino acid sequence identity to BspQI from the sequenced bacterial genome Croceibacter atlanticus HTCC2559. This restriction gene was amplified by PCR and cloned into a T7 expression vector. Restriction mapping and run-off DNA sequencing of digested products from the partially purified enzyme indicated that it is an EarI isoschizomer with 6-bp recognition, which we named CatHI (CTCTTC N1/N4).