アミド水素補血物交換量分析を使用したグルカンホスファターゼダイナミクスに関する構造的洞察

LaforinおよびDarch過剰4（sex4）は、ホスホグルカンを脱リン酸化するホスファターゼのクラスのメンバーを設立しています。各タンパク質には、炭水化物結合モジュール（CBM）と二重特異性ホスファターゼ（DSP）ドメインが含まれています。Laforinをコードする遺伝子は、Lafora疾患（LD）と呼ばれる致命的な神経変性疾患で変異しています。Laforin機能がない場合、過剰リン酸化された不溶性グルカンは、まばらな分岐蓄積を示します。これらの蓄積がLD患者の神経変性と早期死を引き起こすと仮定されています。私たちは最近、ラフォリンがホスホグルカンからリン酸を除去することを実証し、この機能が不溶性のグルカン蓄積を阻害すると仮定しました。植物のsex4機能の喪失は、同様の細胞表現型をもたらします。過剰な量の不溶性で過剰なリン酸化されたグルカンは、細胞に蓄積します。複数のグループは、これらのホスファターゼがホスホグルカンを脱リン酸化することを示していますが、グルカンホスファターゼの構造はなく、この作用を実行するメカニズムについてはほとんど知られていません。我々は、グルカンホスファターゼSex4の立体構造的および構造的ダイナミクスをプローブするために、水素交換量質量分析（DXMS）と構造モデリングを利用しました4。酵素は、グルカン結合時にグローバルな立体構造変化を起こさず、代わりに結合時に最小限の再配置を受けることがわかりました。CBMは、グルカンに縛られたときに重水素からの保護を改善し、グルカンの結合におけるその役割を確認しました。さらに興味深いことに、Glucanの添加時に重水素からの保護も改善したDSPの構造成分を特定しました。これらの領域の位置を決定するために、sex4 dspの相同性モデルを生成しました。相同性モデルは、これらすべての領域がDSPアクティブサイトに隣接していることを示しています。したがって、我々の結果は、DSPのこれらの領域がアクティブサイトへのホスホグルカンの提示に関与し、このユニークなクラスのホスファターゼの最初の構造解析と作用モードを提供することを示唆しています。

Laforin and starch excess 4 (SEX4) are founding members of a class of phosphatases that dephosphorylate phosphoglucans. Each protein contains a carbohydrate binding module (CBM) and a dual-specificity phosphatase (DSP) domain. The gene encoding laforin is mutated in a fatal neurodegenerative disease called Lafora disease (LD). In the absence of laforin function, insoluble glucans that are hyperphosphorylated and exhibit sparse branching accumulate. It is hypothesized that these accumulations trigger the neurodegeneration and premature death of LD patients. We recently demonstrated that laforin removes phosphate from phosphoglucans and hypothesized that this function inhibits insoluble glucan accumulation. Loss of SEX4 function in plants yields a similar cellular phenotype; an excess amount of insoluble, hyperphosphorylated glucans accumulates in cells. While multiple groups have shown that these phosphatases dephosphorylate phosphoglucans, there is no structure of a glucan phosphatase and little is known about the mechanism whereby they perform this action. We utilized hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (DXMS) and structural modeling to probe the conformational and structural dynamics of the glucan phosphatase SEX4. We found that the enzyme does not undergo a global conformational change upon glucan binding but instead undergoes minimal rearrangement upon binding. The CBM has improved protection from deuteration when bound to glucans, confirming its role in glucan binding. More interestingly, we identified structural components of the DSP that also have improved protection from deuteration upon glucan addition. To determine the position of these regions, we generated a homology model of the SEX4 DSP. The homology model shows that all of these regions are adjacent to the DSP active site. Therefore, our results suggest that these regions of the DSP participate in the presentation of the phosphoglucan to the active site and provide the first structural analysis and mode of action of this unique class of phosphatases.