Saccharomyces cerevisiaeのリアルタイムRT-PCRによる定量的発現分析のための参照遺伝子の検証

背景：リアルタイムRT-PCRは、定量的遺伝子発現分析に推奨される方法です。強制ステップは、正規化のための優れた参照遺伝子の選択です。Act1、RDN18、またはPDA1などのハウスキーピング遺伝子（HSK）と呼ばれることが多いいくつかの遺伝子は、その発現が広範な条件で変化しないと想定されるため、最も一般的に使用されているものです。この仮定は非常にありそうもないため、単一参照遺伝子のこの発現変動のこの問題を回避するために、正規化には、慎重に選択された複数の慎重に選択された内部制御遺伝子の幾何学的平均化が強く推奨されています。この研究の目的は、Saccharomyces cerevisiaeでの信頼できる遺伝子発現分析のために、一連の参照遺伝子を検索することでした。 結果：パブリックマイクロアレイデータセットから、グルコースの長期成長中に発現が明らかに不変のままであるようになった潜在的な参照遺伝子を選択しました。アルゴリズムGenormを使用して、ALG9、TAF10、TFC1、およびUBC6を使用して、この研究でテストされた成長条件とひずみのバックグラウンドとは無関係に、発現が安定したままである遺伝子であることが判明しました。次に、6つの最も安定した遺伝子の中で3つの遺伝子のサブセットの幾何学的平均が非常に類似した正規化されたデータをもたらすことを示しました。したがって、選択された複数の遺伝子による正常化は、グリコーゲン代謝に関与する遺伝子の転写分析に適用されました。GPH1で100倍、指数相とグルコースのジアーシフトの間のGSY2で20倍の誘導率を決定しました。ガラクトースでのこの遷移段階でこれら2つの遺伝子の誘導はありませんでしたが、どちらの場合も、グリコーゲンの蓄積の速度論は類似していました。対照的に、SGA1発現は炭素源とは無関係であり、定常期に3倍増加しました。 結論：この研究では、生理学的状態の大きなパネルをカバーする酵母生物学的サンプルのリアルタイムRT-PCRによる定量的遺伝子発現分析に適した参照遺伝子である一連の遺伝子を提供しました。対照的に、酵母の定量的遺伝子発現分析のための内部コントロールとして、Act1および他の一般的に使用される参照遺伝子（PDA1、TDH3、RDN18など）の使用を無効にして阻止します。

BACKGROUND: Real-time RT-PCR is the recommended method for quantitative gene expression analysis. A compulsory step is the selection of good reference genes for normalization. A few genes often referred to as HouseKeeping Genes (HSK), such as ACT1, RDN18 or PDA1 are among the most commonly used, as their expression is assumed to remain unchanged over a wide range of conditions. Since this assumption is very unlikely, a geometric averaging of multiple, carefully selected internal control genes is now strongly recommended for normalization to avoid this problem of expression variation of single reference genes. The aim of this work was to search for a set of reference genes for reliable gene expression analysis in Saccharomyces cerevisiae. RESULTS: From public microarray datasets, we selected potential reference genes whose expression remained apparently invariable during long-term growth on glucose. Using the algorithm geNorm, ALG9, TAF10, TFC1 and UBC6 turned out to be genes whose expression remained stable, independent of the growth conditions and the strain backgrounds tested in this study. We then showed that the geometric averaging of any subset of three genes among the six most stable genes resulted in very similar normalized data, which contrasted with inconsistent results among various biological samples when the normalization was performed with ACT1. Normalization with multiple selected genes was therefore applied to transcriptional analysis of genes involved in glycogen metabolism. We determined an induction ratio of 100-fold for GPH1 and 20-fold for GSY2 between the exponential phase and the diauxic shift on glucose. There was no induction of these two genes at this transition phase on galactose, although in both cases, the kinetics of glycogen accumulation was similar. In contrast, SGA1 expression was independent of the carbon source and increased by 3-fold in stationary phase. CONCLUSION: In this work, we provided a set of genes that are suitable reference genes for quantitative gene expression analysis by real-time RT-PCR in yeast biological samples covering a large panel of physiological states. In contrast, we invalidated and discourage the use of ACT1 as well as other commonly used reference genes (PDA1, TDH3, RDN18, etc) as internal controls for quantitative gene expression analysis in yeast.