定義されたGI/GOタンパク質ヘテロトリマーと結合したヒトヒスタミンH3受容体でのプロキシファンの機能的選択性の証拠はありません

ヒトヒスタミンH（3）受容体（HH（3）R）、シナプス前G（I）/G（O）共役自己受容体およびヘテロセプターを標的とするために、多数の構造的に多様なリガンドが開発されました。プロキシファンは、g（i）/g（o）依存性HH（3）Rシグナル伝達経路に対して異なる効率を持つ機能的に選択的であることが確認されました。ただし、プロキシファンの機能選択性の根本的な分子メカニズムはまだ不明です。現在の研究では、バキュロウイルス/SF9細胞発現システムを使用して、HH（3）Rシグナル伝達における異なるガルファ（I/O）タンパク質の役割を調査しました。定義されたg（i）/g（o） - ヘテロトリマーに対するリガンド特異的結合の違いが、HH（3）rでのプロキシファンの機能的選択性の原因であるという仮説をテストしました。SF9膜では、フルレングスHH（3）R（445アミノ酸）は、過剰な異なる哺乳類Gタンパク質（Galpha（I1）、Galpha（I2）、Galpha（I3）、またはGalpha（O1）と組み合わせて発現して発現しました。およびベータ（1）ガンマ（2）二量体）。さらに、明確に定義された受容体/Gタンパク質の化学量論を確保するために、融合タンパク質HH（3）R-Galpha（I2）およびHH（3）R-Galpha（O1）を構築しました。定常状態のGTPase実験を実施して、HH（3）Rシグナル伝達に対する各Gタンパク質の影響を直接測定しました。HH（3）Rは、すべてのGタンパク質と同様に結合されました。また、同様のリガンド非依存性または構成的活性を観察しました。完全なアゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストなど、プロキシファンおよびその他のさまざまなイミダゾール含有リガンドは、共発現されたGタンパク質のタイプに影響されない非常に類似した薬理学的プロファイルを示しました。融合タンパク質HH（3）R-Galpha（I2）およびHH（3）R-Galpha（O1）（プラスベータ（1）ガンマ（2）二量体）を発現する膜で検査された選択されたリガンドは、非常に類似した結果をもたらしました。集合的に、我々のデータは、HH（3）Rカップルが異なるガルファ（I/O）サブユニットと同様に同様のカップルと、Gタンパク質結合の好みをもたらすリガンド特異的活性受容体の立体構造が、調査されたプロキシファンまたは他のイミダゾール化合物には存在しないことを示しています。。

Numerous structurally diverse ligands were developed to target the human histamine H(3) receptor (hH(3)R), a presynaptic G(i)/G(o)-coupled auto- and heteroreceptor. Proxyfan was identified to be functionally selective, with different efficacies toward G(i)/G(o)-dependent hH(3)R signaling pathways. However, the underlying molecular mechanism of functional selectivity of proxyfan is still unclear. In the current study, we investigated the role of different Galpha(i/o) proteins in hH(3)R signaling, using a baculovirus/Sf9 cell expression system. We tested the hypothesis that ligand-specific coupling differences to defined G(i)/G(o)-heterotrimers are responsible for functional selectivity of proxyfan at hH(3)R. In Sf9 membranes, full-length hH(3)R (445 amino acids) was expressed in combination with an excess of different mammalian G proteins (Galpha(i1), Galpha(i2), Galpha(i3), or Galpha(o1) and beta(1)gamma(2) dimers, respectively). In addition, we constructed the fusion proteins hH(3)R-Galpha(i2) and hH(3)R-Galpha(o1) to ensure clearly defined receptor/G protein stoichiometries. Steady-state GTPase experiments were performed to directly measure the impact of each G protein on hH(3)R signal transduction. The hH(3)R coupled similarly to all G proteins. We also observed similar ligand-independent or constitutive activity. Proxyfan and various other imidazole-containing ligands, including full agonists, partial agonists, and inverse agonists, showed very similar pharmacological profiles not influenced by the type of G protein coexpressed. Selected ligands, examined in membranes expressing the fusion proteins hH(3)R-Galpha(i2) and hH(3)R-Galpha(o1) (plus beta(1)gamma(2) dimers), yielded very similar results. Collectively, our data indicate that hH(3)R couples similarly to different Galpha(i/o)-subunits and that ligand-specific active receptor conformations, resulting in G protein-coupling preferences, do not exist for proxyfan or other imidazole compounds investigated.