神経芽細胞腫におけるグローバルなMYCN転写因子結合分析は、DNA高メチル化の異なるEボックスモチーフおよび領域との関連を明らかにしています

背景：交感神経系の前駆細胞に由来する癌である神経芽細胞腫は、小児がん関連する死亡の主な原因です。この疾患における臨床転帰不良の最も重要な予後指標は、発癌性転写因子のメンバーであるMyCNのゲノム増幅です。 方法論：MYCN増幅/非増幅された細胞株と条件付きノックダウン細胞株を使用して、マイクロアレイ（CHIP-CHIP）にMyCNクロマチン免疫沈降を適用して、すべての注釈付きプロモーター領域内のMyCN結合部位の分布を決定しました。 結論：一貫して陽性のMYCN結合部位内でのEボックス使用の評価により、CATGTGモチーフの優位性が明らかになり（P <0.0016）、MYCN増幅状態の追加のモチーフCattTG、CatCTG、CAACTGが大幅に濃縮されました。MYCNを過剰発現する細胞株の場合、遺伝子オントロジー分析により、DNAヘリカーゼやmRNA転写調節を含む多数の分子機能基のプロモーター領域でのMyCNの結合の濃縮が明らかになりました。他のゲノム特徴に関するMyCN結合を評価するために、メチル化DNA免疫沈降（MEDIP）を使用して、注釈付きのすべてのCPG島とプロモーター配列のメチル化状態を決定しました。MyCNチップチップとMEDIPデータの統合により、MYCN結合とDNA高メチル化の間に非常に有意な正の相関が明らかになりました。この関連は、hemizgous喪失の領域でも検出され、観察された関連が同じホモログで発生することを示しています。要約すると、これらの発見は、MyCN結合が古典的なCACGTG E-Boxモチーフとは対照的にCATGTGでより一般的に発生すること、およびMYCNの過剰発現に関連する疾患は、神経芽細胞腫における追加の弱い親和性Eボックスモチーフに異常な結合につながることを示唆しています。MYCN結合とDNAハイパーメチル化の共局在は、MyCNの二重の役割、つまり個々の遺伝子の活性に影響する古典的な転写因子の二重の役割と、グローバルなクロマチン構造のメディエーターの役割をさらに支持します。

BACKGROUND: Neuroblastoma, a cancer derived from precursor cells of the sympathetic nervous system, is a major cause of childhood cancer related deaths. The single most important prognostic indicator of poor clinical outcome in this disease is genomic amplification of MYCN, a member of a family of oncogenic transcription factors. METHODOLOGY: We applied MYCN chromatin immunoprecipitation to microarrays (ChIP-chip) using MYCN amplified/non-amplified cell lines as well as a conditional knockdown cell line to determine the distribution of MYCN binding sites within all annotated promoter regions. CONCLUSION: Assessment of E-box usage within consistently positive MYCN binding sites revealed a predominance for the CATGTG motif (p<0.0016), with significant enrichment of additional motifs CATTTG, CATCTG, CAACTG in the MYCN amplified state. For cell lines over-expressing MYCN, gene ontology analysis revealed enrichment for the binding of MYCN at promoter regions of numerous molecular functional groups including DNA helicases and mRNA transcriptional regulation. In order to evaluate MYCN binding with respect to other genomic features, we determined the methylation status of all annotated CpG islands and promoter sequences using methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). The integration of MYCN ChIP-chip and MeDIP data revealed a highly significant positive correlation between MYCN binding and DNA hypermethylation. This association was also detected in regions of hemizygous loss, indicating that the observed association occurs on the same homologue. In summary, these findings suggest that MYCN binding occurs more commonly at CATGTG as opposed to the classic CACGTG E-box motif, and that disease associated over expression of MYCN leads to aberrant binding to additional weaker affinity E-box motifs in neuroblastoma. The co-localization of MYCN binding and DNA hypermethylation further supports the dual role of MYCN, namely that of a classical transcription factor affecting the activity of individual genes, and that of a mediator of global chromatin structure.