PhotolaseによるDNA修復：UVの過渡吸収研究のために、265 nm前後の低いバックグラウンド吸収を伴う新規基質

CPDフォトリアーゼは、損傷反応のフォトリバージョンにより、DNAの主要なUV誘発性病変であるシクロブタンピリミジン二量体（CPD）を酵素的に修復します。酵素に結合したフラビン（FADH（ - ））補因子は、光増感剤として機能します。励起時に、電子をCPDに一時的に透過し、ピリミジン間結合の硬化を引き起こします。修復の完了後、電子はフラビンに戻り、機能還元型を回復します。酵素修復反応の時間分解分光モニタリングの主な困難は、ピリミジンの回復に付随するピリミジン回復を伴う265 nm前後の吸収変化が、DNAの非浸潤塩基の強いバックグラウンド吸収によって不明瞭になることです。ここでは、265 nm前後の弱いだけ吸収するCPDフォトリアーゼの新規基質を提示します。中央CPDと3 '末端のものを除くすべての塩基を備えた修飾チミジン10-MERが、実質的に行う5,6-ジヒドロチミンに置き換えられます。約265 nmを吸収しないでください。Anacystis nidulansおよびEscherichia coliからのフォトリアーゼによるこの基質の修復と、2つの従来の基質の修復と比較されました。中央CPDを含む10-MERの未修飾チミジンと、平均6つのランダムに分布したCPDSの平均を含むアセトン感染チミジン18-Merを含む18merストランドごと。すべての場合において、新しい基質は、従来の基質の効率と非常によく似た効率で修復されました（FADH（ - ）の励起時に0.5程度の量子収量）。267 nmでのフラッシュ誘導の過渡吸収変化は、単一の飽和フラッシュを備えたミリ秒の時間スケールで記録でき、3つの基質すべてについて非常に類似した信号を生成しました。265 nm前後のバックグラウンド吸収が低く、定義された構造のため、新規基質は、CPDフォトリアーゼによるピリミジン二量体分裂に関する高速および超高速の一過性吸収研究のための有望なツールです。

CPD photolyase enzymatically repairs the major UV-induced lesion in DNA, the cyclobutane pyrimidine dimer (CPD), by photoreversion of the damage reaction. An enzyme-bound reduced flavin (FADH(-)) cofactor functions as photosensitizer. Upon excitation, it transiently transfers an electron to the CPD, triggering scission of the interpyrimidine bonds. After repair completion, the electron returns to the flavin to restore its functional reduced form. A major difficulty for time-resolved spectroscopic monitoring of the enzymatic repair reaction is that absorption changes around 265 nm accompanying pyrimidine restoration are obscured by the strong background absorption of the nondimerized bases in DNA. Here we present a novel substrate for CPD photolyase that absorbs only weakly around 265 nm: a modified thymidine 10-mer with a central CPD and all bases, except the one at the 3' end, replaced by 5,6-dihydrothymine which virtually does not absorb around 265 nm. Repair of this substrate by photolyases from Anacystis nidulans and from Escherichia coli was compared with repair of two conventional substrates: a 10-mer of unmodified thymidines containing a central CPD and an acetone-sensitized thymidine 18-mer that contained in average six randomly distributed CPDs per strand. In all cases, the novel substrate was repaired with an efficiency very similar to that of the conventional substrates (quantum yields in the order of 0.5 upon excitation of FADH(-)). Flash-induced transient absorption changes at 267 nm could be recorded on a millisecond time scale with a single subsaturating flash and yielded very similar signals for all three substrates. Because of its low background absorption around 265 nm and the defined structure, the novel substrate is a promising tool for fast and ultrafast transient absorption studies on pyrimidine dimer splitting by CPD photolyase.