遺伝子キャリアのエンドサイトーシス経路を研究するための阻害剤の使用：最適化と落とし穴

非ウイルス遺伝子複合体は、異なるエンドサイトーシス経路を介して哺乳類細胞に入ることができます。遺伝子担体の効率的な最適化のために、細胞内の処理とその後のトランスフェクション効率を大きく決定するため、細胞の取り込みをプロファイルすることが重要です。これらの遺伝子配送車両の取り込みに関する現在の情報のほとんどは、エンドサイトーシス経路の化学阻害剤の使用後のデータに基づいています。ここでは、5つのよく説明されている細胞株で細胞生存率とエンドサイトーシスについて、一般的に使用される4つのエンドサイトーシス阻害剤[クロルプロマジン、ゲニステイン、メチルベータシクロデキストリン（MBETACD）、およびカリウム枯渇]の詳細な特性評価を実施しました。クロルプロマジンと程度は低い程度では、短いインキュベーション期間後およびエンドサイトーシスの阻害に日常的に使用される濃度でも、一部の細胞株の細胞生存率が大幅に低下することがわかりました。クラスリン依存性（CDE）およびクラスリン非依存性（CIE）メカニズムを介して細胞に侵入することが報告されている2つの蛍光エンドサイトーシスプローブトランスフェリンとラクトシルセラミド（LACCER）の取り込みと細胞内分布を分析することにより、これらのエージェントの特異性が低いことを示しました。異なるエンドサイトーシス経路を阻害します。最後に、阻害効果は細胞株に依存していることを実証します。全体として、データは、非常に厳しいコントロールがない場合、これらの薬剤を使用してエンドサイトーシス研究を行うことの重要性に疑問を呈しています。

Nonviral gene complexes can enter mammalian cells through different endocytic pathways. For efficient optimization of the gene carrier it is important to profile its cellular uptake, because this largely determines its intracellular processing and subsequent transfection efficiency. Most of the current information on uptake of these gene-delivery vehicles is based on data following the use of chemical inhibitors of endocytic pathways. Here, we have performed a detailed characterization of four commonly used endocytosis inhibitors [chlorpromazine, genistein, methyl-beta-cyclodextrin (MbetaCD), and potassium depletion] on cell viability and endocytosis in five well-described cell lines. We found that chlorpromazine and to a lesser extent MbetaCD significantly decreased cell viability of some cell lines even after short incubation periods and at concentrations that are routinely used to inhibit endocytosis. Through analyzing the uptake and subcellular distribution of two fluorescent endocytic probes transferrin and lactosylceramide (LacCer) that are reported to enter cells via clathrin-dependent (CDE) and clathrin-independent (CIE) mechanisms, respectively, we showed poor specificity of these agents for inhibiting distinct endocytic pathways. Finally, we demonstrate that any inhibitory effects are highly cell line dependent. Overall, the data question the significance of performing endocytosis studies with these agents in the absence of very stringent controls.