ヒト網膜色素上皮細胞におけるリポフスチン形成とオートファジーに対する脂質過酸化産物の効果

いくつかの証拠は、網膜色素上皮（RPE）の進行性機能障害が、加齢性黄斑変性（AMD）の病因の中心であることを示唆しています。以前に、4-ヒドロキシノネナール（HNE）やマロンディアルデヒド（MDA）などの脂質過酸化生成物を使用したタンパク質修飾が、in vitroでRPE細胞のリソソーム機能障害を誘導することを実証しました。ここでは、リソソーム機能に直接接続された2つの相互に関連するプロセスであるリポフスチン形成とオートファジーに、修飾された光受容体外部セグメント（POS）の食作用が影響するかどうかを調査しました。HNEおよびMDA修飾POSとのヒトRPE細胞のインキュベーションは、リポフスチン様の自己蛍光と顆粒物質の細胞内蓄積を顕著に引き起こしました。修正POSで7日間治療した後、細胞の自己蛍光はフローサイトメトリーによって定量化されて8.2倍増加しました。リソソーム阻害剤塩化アンモニウムの存在下で、修飾されていないPOSは同様に、自己蛍光の8.0倍の増加を誘発しました。修飾POSとのインキュベーション後の細胞自己蛍光のスペクトルプロファイルは、ネイティブPOSとのインキュベーションと比較して変更されていませんでした。代謝的に放射性標識内因性タンパク質の代謝回転として測定されたオートファジー活性は、HNEおよびMDA修飾POSの両方によって40％減少しました。塩化アンモニウムによる3-メチルアデニンおよびリソソーム阻害によるオートファジー阻害は、POSの非存在下でもリポフスチン生成を誘発しました。要約すると、我々の結果は、脂質過酸化由来のタンパク質修飾によるリソソーム機能障害の誘導により、リポフスチン形成の増加とin vitroでのRPE細胞のオートファジー活性の低下が生じることを示しています。これらのメカニズムは、AMDのRPE細胞機能障害と変性に寄与する可能性があります。

Several lines of evidence suggest that progressive dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE) is central to the pathogenesis of age-related macular degeneration (AMD). We previously demonstrated that protein modifications with lipid peroxidation products, such as 4-hydroxynonenal (HNE) and malondialdehyde (MDA), induce lysosomal dysfunction in RPE cells in vitro. Here, we investigated whether phagocytosis of modified photoreceptor outer segments (POS) affects lipofuscinogenesis and autophagy, two interrelated processes directly connected to lysosomal function. Incubation of human RPE cells with HNE- and MDA-modified POS resulted in pronounced intracellular accumulation of granular material with lipofuscin-like autofluorescence. After daily treatment with modified POS for 7 days, cellular autofluorescence increased 8.2-fold as quantified by flow cytometry. In the presence of the lysosomal inhibitor ammonium chloride, unmodified POS likewise induced an 8.0-fold increase in autofluorescence. Spectral profiles of cellular autofluorescence after incubation with modified POS were unchanged compared to incubation with native POS. Autophagy activity, measured as turnover of metabolically radiolabeled endogenous proteins, was reduced by both HNE- and MDA-modified POS by 40%. Autophagy inhibition by 3-methyladenine and lysosomal inhibition by ammonium chloride induced lipofuscinogenesis even in the absence of POS. In summary, our results demonstrate that induction of lysosomal dysfunction by lipid peroxidation-derived protein modifications results in increased lipofuscinogenesis and reduced autophagy activity in RPE cells in vitro. These mechanisms may contribute to RPE cell dysfunction and degeneration in AMD.