重原子標識（FD-HAL）の蛍光検出：段階的に修飾されたシステイン残基をフェーシング原子によって識別する迅速な方法

膜タンパク質の結晶学は、結晶の回折が不十分で、データ収集前に重い原子誘導体を特定できないため、相測定段階で頻繁に失速します。したがって、大部分の時間、労力、リソースは、重い原子標識の知識なしに、シンクロトロンのデータ収集と分析のための潜在的な誘導結晶の準備に投資されています。この不確実性を除去するために、テトラメチルホダミン-5-マレイミド（蛍光マレイミド化合物）を使用して、ヘビー原子標識（FD-HAL）の蛍光検出を導入して、ゲル内システイン残留性のアクセシビリティを監視し、水銀、白金化合物、金の化合物による共有結合修飾を確認します。この手法を3つの積分膜タンパク質（LACY、VSGLT、およびMVDAC1）でテストし、結晶フェージングを促進するために遊離システイン残基を誘導するための最適な濃度、時間、重原子化合物を迅速に評価できます。これは、重い原子を戦略的位置に組み込むためのシステインスキャンと組み合わせて、膜タンパク質構造の偏りにかなり役立つ有用なツールです。

Membrane protein crystallography frequently stalls at the phase determination stage due to poor crystal diffraction and the inability to identify heavy atom derivatization prior to data collection. Thus, a majority of time, effort and resources are invested preparing potential derivatized crystals for synchrotron data collection and analysis without knowledge of heavy atom labeling. To remove this uncertainty, we introduce Fluorescence Detection of Heavy Atom Labeling (FD-HAL) using tetramethylrhodamine-5-maleimide (a fluorescent maleimide compound) to monitor in-gel cysteine residue accessibility and ascertain covalent modification by mercury, platinum and gold compounds. We have tested this technique on three integral membrane proteins (LacY, vSGLT and mVDAC1) and can quickly assess the optimal concentrations, time and heavy atom compound to derivatize free cysteine residues in order to facilitate crystal phasing. This, in conjunction with cysteine scanning for incorporating heavy atoms at strategic positions, is a useful tool that will considerably assist in phasing membrane protein structures.