Tループリン酸化CDK9は、活性P-TEFB機能の部位として機能し、BRD4と7SK/Hexim1調節錯体の間の交換の部位として機能する核スペックルドメインに局在します

P-TEFBは、RNAポリメラーゼIIの最大サブユニットのカルボキシル末端ドメインをリン酸化することにより、RNAポリメラーゼII転写の伸長ステップを誘導するように機能します。コアP-TEFBは、CDK9とサイクリン調節サブユニットで構成され、サイクリンT1は主要なCDK9関連サイクリンです。P-TEFBのキナーゼ活性は、CDK9サブユニットのTループドメイン内にあるThr186残基のリン酸化に依存しています。ここでは、免疫蛍光デコンボリューション顕微鏡を使用して、ホスホ-THR186 CDK9/サイクリンT1 P-TEFBヘテロダイマーの細胞内分布を調べました。ホスホ-THR186 CDK9は、非核小核核形成全体に点状分布を表示し、核スペックルドメイン内にほぼ独占的にサイクリンT1と共局在することがわかりました。ホスホ-THR186 CDK9は、主にRNAポリメラーゼIIの過リン酸化型と共局在しています。キナーゼ欠損CDK9変異体の一時的な発現は、どちらもCDK9スペックルの局在化に必要なThr186リン酸化またはキナーゼ活性ではないことを明らかにしました。最後に、Brd4およびHexim1タンパク質の両方が、スペックルドメインまたは非常に近くのP-TEFBと相互作用し、CDK9阻害剤フラボピリドールによる細胞の処理はこの分布を変化させます。これらの結果は、P-TEFBの活性型が核斑点に存在し、斑点がP-TEFB機能の部位であり、陰性と陽性のP-TEFB調節錯体の間の交換である可能性を高めることを示しています。

P-TEFb functions to induce the elongation step of RNA polymerase II transcription by phosphorylating the carboxyl-terminal domain of the largest subunit of RNA polymerase II. Core P-TEFb is comprised of Cdk9 and a cyclin regulatory subunit, with Cyclin T1 being the predominant Cdk9-associated cyclin. The kinase activity of P-TEFb is dependent on phosphorylation of the Thr186 residue located within the T-loop domain of the Cdk9 subunit. Here, we used immunofluorescence deconvolution microscopy to examine the subcellular distribution of phospho-Thr186 Cdk9/Cyclin T1 P-TEFb heterodimers. We found that phospho-Thr186 Cdk9 displays a punctate distribution throughout the non-nucleolar nucleoplasm and it co-localizes with Cyclin T1 almost exclusively within nuclear speckle domains. Phospho-Thr186 Cdk9 predominantly co-localized with the hyperphosphorylated forms of RNA polymerase II. Transient expression of kinase-defective Cdk9 mutants revealed that neither is Thr186 phosphorylation or kinase activity required for Cdk9 speckle localization. Lastly, both the Brd4 and HEXIM1 proteins interact with P-TEFb at or very near speckle domains and treatment of cells with the Cdk9 inhibitor flavopiridol alters this distribution. These results indicate that the active form of P-TEFb resides in nuclear speckles and raises the possibility that speckles are sites of P-TEFb function and exchange between negative and positive P-TEFb regulatory complexes.