機能的なゲノミクススクリーンは、ニコチアナ・ベンサミアナのアルカロイド生合成を調節する多様な転写因子を識別します

ニコチアナ種におけるアルカロイドニコチンの生合成は、昆虫の損傷とジャスモン酸の応用によって誘導されます。ニコチン経路の転写調節を調べるために、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（VIG）に適したウイルスベクターに直接、ジャスモン酸メチル（MEJA）で処理されたニコチアナベンサミアナ根から2つの減算cDNAライブラリを構築しました。cDNAインサートのシーケンスにより、ジャスモン酸応答性遺伝子が濃縮され、69の推定転写因子（TF）が含まれる3271発現シーケンスタグ（EST; 1898ユニゲン）のデータセットが生成されました。ニコチン代謝に対する効果を判断するためのVIGSスクリーニングの後、3つの異なるTFファミリーからの6つのTFが構成的およびMeja誘発性葉のニコチンレベルを変化させました。基本的なヘリックスループヘリックス（BHLH）TF、NBBHLH3、およびオーキシン応答因子TF、NBARF1のVIGは、コントロールプラントと比較してニコチン含有量を増加させました。BHLHファミリーメンバー、NBBHLH1およびNBBHLH2、エチレン応答因子TF、NBERF1、およびホメオボックスドメインのようなTF、NBHB1を沈黙させ、ニコチンレベルを低下させました。トランスジェニックN. benthamiana植物は、nbbhlh1またはnbbhlh2を過剰発現している植物を、ベクターコントロールと比較して葉のニコチンレベルの増加を示しました。RNAiのサイレンシングは、ニコチンの減少とニコチン経路の酵素の転写産物エンコーディングのレベルの低下の両方をもたらしました。電気泳動移動度シフトアッセイにより、組換えNbBHLH1およびNbBHLH2は、プトレシンN-メチルトランスフェラーゼプロモーターから識別されたG-box要素に直接結合することが示されました。Nbbhlh1およびNbbhlh2は、ニコチン生合成のジャスモン酸活性化における正の調節因子として機能すると結論付けています。

Biosynthesis of the alkaloid nicotine in Nicotiana species is induced by insect damage and jasmonate application. To probe the transcriptional regulation of the nicotine pathway, we constructed two subtracted cDNA libraries from methyl jasmonate (MeJA)-treated Nicotiana benthamiana roots directly in a viral vector suitable for virus-induced gene silencing (VIGS). Sequencing of cDNA inserts produced a data set of 3271 expressed sequence tags (ESTs; 1898 unigenes), which were enriched in jasmonate-responsive genes, and included 69 putative transcription factors (TFs). After a VIGS screen to determine their effect on nicotine metabolism, six TFs from three different TF families altered constitutive and MeJA-induced leaf nicotine levels. VIGS of a basic helix-loop-helix (bHLH) TF, NbbHLH3, and an auxin response factor TF, NbARF1, increased nicotine content compared with control plants; silencing the bHLH family members, NbbHLH1 and NbbHLH2, an ethylene response factor TF, NbERF1, and a homeobox domain-like TF, NbHB1, reduced nicotine levels. Transgenic N. benthamiana plants overexpressing NbbHLH1 or NbbHLH2 showed increased leaf nicotine levels compared with vector controls. RNAi silencing led to both reduced nicotine and decreased levels of transcript encoding of enzymes of the nicotine pathway. Electrophoretic mobility shift assays showed that recombinant NbbHLH1 and NbbHLH2 directly bind G-box elements identified from the putrescine N-methyltransferase promoter. We conclude that NbbHLH1 and NbbHLH2 function as positive regulators in the jasmonate activation of nicotine biosynthesis.