リアルタイムの定量的PCRによる真菌遺伝子発現の分析

リアルタイムの定量PCR（QPCR）メソッドは、他のアプリケーションと同様に遺伝子発現の定量化の中心となっています。QPCRの主な利点は、少量のテンプレートの利用、高感度、および反応中に製品を検出する能力です。他のオプション（ノーザンブロット、半定量的PCR）の中からQPCRを選択した後、いくつかの要因を考慮する必要があります。菌類のQPCRの最初で重要なステップは、適切な成長培地およびRNA抽出方法の選択であり、阻害剤の蓄積を避けます。この章では、Syber Green Dyeを使用した蓄積製品の検出に焦点を当てていますが、ハイブリダイゼーションプローブなどの他の検出技術も考慮される可能性があります。Syber Greenを使用した正確なQPCR分析は、主に最適なPCR反応に依存するため、干渉構造の形成を避けるプライマーを設計することが重要です。このプロトコルで説明されているように、サンプル内のテンプレートの絶対的な定量化を使用したり、相対的な分析を行うことができます。相対分析方法では、関心の遺伝子の発現を参照遺伝子の発現と比較します。私たちの経験と文献によると、信頼できる結果を得るために少なくとも3つの参照遺伝子を使用することをお勧めします。

The Real-Time quantitative PCR (qPCR) method has become central for the quantification of gene expression as well as other applications. The major advantages of qPCR are the utilization of small amount of template, high sensitivity and the ability to detect products during the reaction. After selecting qPCR among other options (northern blot, semi-quantitative PCR), one should consider several factors. The first and critical step in qPCR of fungi is the selection of an appropriate growth medium and RNA extraction method, which will avoid accumulation of inhibitors. In this chapter, we focus on detection of the accumulating product with the Syber Green dye, but other detection technologies, such as hybridization probes, might be considered as well. Accurate qPCR analysis with Syber Green depends mainly on optimal PCR reaction, and therefore it is important to design primers that will avoid formation of interfering structures. It is possible to use absolute quantification of the template in the sample, or to conduct a relative analysis, as described in this protocol. In the relative analysis method, expression of the gene of interest is compared with expression of a reference gene. According to our experience as well as according to the literature, it is recommended to use at least three reference genes in order to obtain reliable results.