電気泳動移動度シフトアッセイの原理と問題

はじめに：電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、DNA結合タンパク質を検出するために古典的に使用されます。EMSAの教義は、タンパク質に結合したDNAは、対応する遊離非結合DNAよりもポリアクリルアミドゲルをゆっくり介して移動することです。 方法：古典的なEMSAプロトコルには4つの主要なステップがあります。1）細胞からのタンパク質の分離。活性DNA結合タンパク質の大部分が核内に存在するため、精製された核タンパク質を生成する連続膜溶解プロトコルが使用されます。2）DNAプローブの製造と放射標識。リン32（（32）P）は、T4ポリヌクレオチドキナーゼの基質として（32）P-γATPを使用することにより、DNAプローブの5 '末端に付着します。DNAプローブは、購入またはカスタムメイドの両方を使用できます。3）精製されたタンパク質と放射性標識DNAプローブは、DNAプローブを使用したタンパク質の結合を促進するために、EMSA結合バッファーと共インキュベートします。SuperShift EMSAが実行されている場合、反応にはタンパク質DNA複合体に結合した場合、ゲル内でさらなる遅延を引き起こす選択的抗体も含まれています。4）DNAタンパク質複合体はロードされ、非変異性ポリアクリルアミドゲルに走行し、遊離DNAプローブからDNA間タンパク質複合体の分離を引き起こします。次に、ポリアクリルアミドゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーを介して分析します。 結果：このプロトコルの有効性の実証として、A549細胞の腫瘍壊死因子（TNF）αおよびホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）刺激が、多くのDNAタンパク質複合体が誘導されることを示しています。未処理の細胞と比較して。また、これらの複合体には、EMSAスーパーシフトプロトコルの利用を通じてNF-κBのP50およびP65サブユニットが含まれていることも実証しています。 ディスカッション：この手法の詳細なトラブルシューティングのヒントを提供し、EMSAの限界、および多くのEMSAバリアントと代替技術について説明します。

INTRODUCTION: The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is classically used to detect DNA binding proteins, the tenet of the EMSA is that DNA with protein bound, migrates through a polyacrylamide gel more slowly than the corresponding free unbound DNA. METHODS: The classical EMSA protocol has 4 major steps: 1) The isolation of proteins from cells. Since the vast majority of active DNA binding proteins are present within the nucleus, a sequential membrane lysis protocol is used which yields purified nuclear protein. 2) Manufacture and radiolabelling of the DNA probe. Phosphorous 32 ((32)P) is attached to the 5' ends of the DNA probe through use of (32)P-γATP as a substrate for T4 polynucleotide kinase. DNA probes can both be purchased or custom made. 3) Purified proteins and radiolabelled DNA probes are co-incubated with an EMSA binding buffer to promote binding of the proteins with the DNA probe. If a supershift EMSA is being carried out, the reaction also contains a selective antibody which when bound to the protein-DNA complexes, causes further retardation within the gel. 4) The DNA-protein complexes are loaded and run on a non-denaturing polyacrylamide gel causing separation of the DNA-protein complexes from the free DNA probes. The polyacrylamide gels are then dried down and analysed via autoradiography. RESULTS: As a demonstration of the effectiveness of this protocol, we show that tumour necrosis factor (TNF)α and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) stimulation of A549 cells, results in a number of DNA-protein complexes being induced when compared to untreated cells. We also demonstrate that these complexes contain the p50 and p65 subunits of NF-κB through utilisation of the EMSA supershift protocol. DISCUSSION: We provide detailed troubleshooting hints and tips for this technique and discuss the limitations of the EMSA, as well as a number of EMSA variants and alternative techniques.