炭水化物が高リコシル化されたヒトインターフェロンアルファムテインの安定性と構造に及ぼす影響

タンパク質の物理的および化学的不安定性は、生産から最終配達まで、プロセスのあらゆる段階でのバイオ医薬品の開発における主要な課題の1つです。これは、特に、さまざまな癌および慢性ウイルス性疾患の治療に世界中で使用されている多面的なサイトカインであるヒト組換えインターフェロンアルファ-2b（Rhifn-alpha2b）に適用できます。以前の研究では、重度のグリコシル化IFNバリアント（4N-IFN）を構築するために4つのN-グリコシル化部位を導入すると、著しく長く伸びた血漿半減期が得られることが実証されました。市販の非グリコシル化RHIFN-α2B（Ng-IFN）との比較。ここでは、さまざまな環境条件に対する4N-IFNのin vitro安定性に対するグリコシル化の影響を評価しました。興味深いことに、高リコシル化サイトカインは、Ng-IFNと比較して、熱ストレス、酸pH、反復凍結融解サイクルに対する安定性の向上を示しました。その上、微量回数分析は、4N-IFNのはるかに高い融解温度を示し、NG-IFNの挙動とは対照的に、実験の終了時に降水がないことによって示されるように、このバリアントのより高い溶解度を示しています。さらに、4n-IFNの遠方riv丸二胞体（CD）スペクトルは、NG-IFNのそれとほぼ重ね合わされ、IFN構造が炭水化物部分の添加によって変化しなかったことを示しています。同じ結論は、限られたタンパク質分解研究から推測できます。我々の結果は、Glycoengineeringが、さまざまな外部要因による不活性化からRhifn-alpha2bを保護し、生産プロセスと貯蔵中の集約問題を克服するための有用な戦略になる可能性があることを示唆しています。

Protein physical and chemical instability is one of the major challenges in the development of biopharmaceuticals during every step of the process, ranging from production to final delivery. This is particularly applicable to human recombinant interferon alpha-2b (rhIFN-alpha2b), a pleiotropic cytokine currently used worldwide for the treatment of various cancer and chronic viral diseases, which presents a poor stability in solution. In previous studies, we have demonstrated that the introduction of four N-glycosylation sites in order to construct a heavily glycosylated IFN variant (4N-IFN) resulted in a markedly prolonged plasma half-life which was reflected in an enhanced therapeutic activity in mice in comparison with the commercial non-glycosylated rhIFN-alpha2b (NG-IFN). Herein, we evaluated the influence of glycosylation on the in vitro stability of 4N-IFN towards different environmental conditions. Interestingly, the hyperglycosylated cytokine showed enhanced stability against thermal stress, acid pH and repetitive freeze-thawing cycles in comparison with NG-IFN. Besides, microcalorimetric analysis indicated a much higher melting temperature of 4N-IFN, also demonstrating a higher solubility of this variant as denoted by the absence of precipitation at the end of the experiment, in contrast with the NG-IFN behaviour. Furthermore, far-UV circular dichroism (CD) spectrum of 4N-IFN was virtually superimposed with that of NG-IFN, indicating that the IFN structure was not altered by the addition of carbohydrate moieties. The same conclusion could be inferred from limited proteolysis studies. Our results suggest that glycoengineering could be a useful strategy for protecting rhIFN-alpha2b from inactivation by various external factors and for overcoming aggregation problems during the production process and storage.