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Importin-Alphaは、それぞれ塩基性アミノ酸の1つまたは2つのクラスターを含む古典的な独占核および二部核局在化シーケンス（CNLS）を認識する核輸入受容体です。単一の生物の異なるインポートアルファパラログは、カルゴスの明確なレパートリーに特異的です。構造研究により、単党のCNLSSと、主要なCNLS結合部位と呼ばれるImportin-alphaの同じサイトに結合する二部CNLSSのC末端基本クラスターが示されました。5つの縮退位置を持つ配向ペプチドライブラリーアプローチを使用して、インポートアルファの主要なCNLS結合部位の特異性を調べました。シーケンスをKKKRR、KKKRK、およびKKRKKを、それぞれマウスImportin-Alpha2、ヒトα-alpha1、およびヒトのインポートアルファ5のこの部位に結合するための最適なシーケンスとして特定しました。最適なペプチドを備えたマウスインポートα2の結晶構造により、Simianウイルス40の大きな腫瘍抗原CNLの結合に似た予想される結合モードが確認されました。結合アッセイにより、これらの配列を含むペプチドが、ナノモルの親和性が低い対応するタンパク質に結合していることが確認されました。核輸入アッセイは、配列が機能的CNLSとして機能し、特定のインポーチンアルファに特異的に作用することを示した。構造情報がインポートアルファの指向性ペプチドライブラリスクリーニングアプローチにリンクされているのはこれが初めてです。結果は、CNLSSの配列決定要因の理解に貢献し、新規タンパク質のまだ正体不明のCNLSを特定するのに役立つ可能性があります。
Importin-Alphaは、それぞれ塩基性アミノ酸の1つまたは2つのクラスターを含む古典的な独占核および二部核局在化シーケンス（CNLS）を認識する核輸入受容体です。単一の生物の異なるインポートアルファパラログは、カルゴスの明確なレパートリーに特異的です。構造研究により、単党のCNLSSと、主要なCNLS結合部位と呼ばれるImportin-alphaの同じサイトに結合する二部CNLSSのC末端基本クラスターが示されました。5つの縮退位置を持つ配向ペプチドライブラリーアプローチを使用して、インポートアルファの主要なCNLS結合部位の特異性を調べました。シーケンスをKKKRR、KKKRK、およびKKRKKを、それぞれマウスImportin-Alpha2、ヒトα-alpha1、およびヒトのインポートアルファ5のこの部位に結合するための最適なシーケンスとして特定しました。最適なペプチドを備えたマウスインポートα2の結晶構造により、Simianウイルス40の大きな腫瘍抗原CNLの結合に似た予想される結合モードが確認されました。結合アッセイにより、これらの配列を含むペプチドが、ナノモルの親和性が低い対応するタンパク質に結合していることが確認されました。核輸入アッセイは、配列が機能的CNLSとして機能し、特定のインポーチンアルファに特異的に作用することを示した。構造情報がインポートアルファの指向性ペプチドライブラリスクリーニングアプローチにリンクされているのはこれが初めてです。結果は、CNLSSの配列決定要因の理解に貢献し、新規タンパク質のまだ正体不明のCNLSを特定するのに役立つ可能性があります。
Importin-alpha is the nuclear import receptor that recognizes the classic monopartite and bipartite nuclear localization sequences (cNLSs), which contain one or two clusters of basic amino acids, respectively. Different importin-alpha paralogs in a single organism are specific for distinct repertoires of cargos. Structural studies revealed that monopartite cNLSs and the C-terminal basic clusters of the bipartite cNLSs bind to the same site on importin-alpha, termed the major cNLS-binding site. We used an oriented peptide library approach with five degenerate positions to probe the specificity of the major cNLS-binding site in importin-alpha. We identified the sequences KKKRR, KKKRK, and KKRKK as the optimal sequences for binding to this site for mouse importin-alpha2, human importin-alpha1, and human importin-alpha5, respectively. The crystal structure of mouse importin-alpha2 with its optimal peptide confirmed the expected binding mode resembling the binding of simian virus 40 large tumor-antigen cNLS. Binding assays confirmed that the peptides containing these sequences bound to the corresponding proteins with low nanomolar affinities. Nuclear import assays showed that the sequences acted as functional cNLSs, with specificity for particular importin-alphas. This is the first time that structural information has been linked to an oriented peptide library screening approach for importin-alpha; the results will contribute to understanding of the sequence determinants of cNLSs, and may help identify as yet unidentified cNLSs in novel proteins.
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