データに依存しない多重化ペプチド断片化によるタンパク質とプロテオームのカバレッジの改善

データに依存しない取得（DIA）LC/MS（E）およびデータ依存的獲得（DDA）LC/MS/MSアプローチによって達成されるタンパク質およびプロテオームの特性評価のパフォーマンスの違いが調査されました。LC/MS（E）は、LC/MS/MSとは対照的に、すべてのコーティング前駆体の生成モードを並列に生成する新しいモードです。LC/MS（E）分析中に、すべての前駆体が完全なクロマトグラフィー溶出全体に断片化されるため、「通常」および「上昇」衝突エネルギーの交互のMSスキャンが定期的に収集され、前駆体検出と断片化のためにほぼ100％のデューティサイクルを提供します。プロフィール。これは、前駆体イオンのシリアル選択が、採用された強度駆動型の尋問スキームにより、最高の存在量サンプル成分の尋問と検出に偏っているDDAベースのMS/MSとは対照的です。両方の取得モードは、濃度が16倍のダイナミックレンジを持つ単純な4タンパク質標準混合物、免疫沈降により精製されたシロイヌナズナのタリアナタンパク質FLS2のゲル消化、および溶液が消化されたトマト葉プロテオームサンプルのゲル化に適用されました。個々のタンパク質配列カバレッジの劇的な改善は、DIAアプローチによって分析された3つのサンプルすべて、特に最も低い存在量サンプル成分について得られました。多くの場合、DIA中に容易に検出および識別された前駆体は、クロマトグラフィー溶出プロファイルの不適切なポイントでDDA中にMS/MSによって尋問され、品質の生成物イオンスペクトルが不十分であるか、まったく尋問されませんでした。DDAとDIAの両方のRAWデータの詳細な評価とMS-T-MS/MSスイッチングイベントのタイミングにより、シリアルMS/MS尋問の基本的な制限と、より包括的なタンパク質の識別と特性評価のためのDIAによる並列断片化の利点が明らかになりました。強化されたアイソフォームおよび翻訳後修飾分析の約束。

Performance differences in protein and proteome characterization achieved by data-independent acquisition (DIA) LC/MS(E) and data-dependent acquisition (DDA) LC/MS/MS approaches were investigated. LC/MS(E) is a novel mode of generating product ion data for all coeluting precursors in parallel as opposed to LC/MS/MS where coeluting precursors must be serially fragmented one at a time. During LC/MS(E) analysis, alternating MS scans of "normal" and "elevated" collision energy are collected at regular intervals, providing nearly a 100% duty cycle for precursor detection and fragmentation because all precursors are fragmented across their full chromatographic elution profile. This is in contrast to DDA-based MS/MS where serial selection of precursor ions is biased toward interrogation and detection of the highest abundance sample components by virtue of the intensity-driven interrogation scheme employed. Both modes of acquisition were applied to a simple four-protein standard mixture with a 16-fold dynamic range in concentration, an in-gel digest of the Arabidopsis thaliana protein FLS2 purified by immunoprecipitation, and a solution-digested tomato leaf proteome sample. Dramatic improvement for individual protein sequence coverage was obtained for all three samples analyzed by the DIA approach, particularly for the lowest abundance sample components. In many instances, precursors readily detected and identified during DIA were either interrogated by MS/MS during DDA at inopportune points in their chromatographic elution profiles resulting in poor quality product ion spectra or not interrogated at all. Detailed evaluation of both DDA and DIA raw data and timing of the MS-to-MS/MS switching events clearly revealed the fundamental limitations of serial MS/MS interrogation and the advantages of parallel fragmentation by DIA for more comprehensive protein identification and characterization which holds promise for enhanced isoform and post-translational modification analysis.