オートファジーのための新しい定量的フローサイトメトリーベースのアッセイ

オートファジーは、栄養センシング、ストレス反応、発達などの多くの生物学的経路でますます重要性がますます認識されている細胞分解プロセスです。EGFP-LC3レポータータンパク質とフローサイトメトリーのスループット能力と定量的パワーを組み合わせたオートファジーのための簡単なアッセイを提示します。サポニン抽出はタンパク質のEGFP-LC3-I型に関連する非オートファゴソームに特異的であるため、フローサイトメトリーを使用して、サポニン抽出されたHOS-EGFP-LC3細胞の総蛍光を測定してオートファゴソーム関連EGFP-LC3-II。分解の阻害剤と組み合わせて、このアッセイを採用して、構成的オートファジーと誘導性オートファジーを区別し、システムのフラックスの変化を定量化しました。さらに、内因性LC3タンパク質の直接抗体染色を使用して、このアッセイを非トランスフェクト細胞のオートファゴソーム形成の検出に拡張しました。

Autophagy is a cellular degradation process with an increasingly recognised importance in many biological pathways such as nutrient sensing, stress responses and development. We present a straightforward assay for autophagy which combines the sensitivity of the EGFP-LC3 reporter protein with the throughput capacity and quantitative power of flow cytometry. Because saponin extraction is specific for the non-autophagosome associated EGFP-LC3-I form of the protein, flow cytometry can be used to measure total fluorescence of saponin extracted HOS-EGFP-LC3 cells as a measure of the levels of autophagosome associated EGFP-LC3-II. Combined with inhibitors of degradation, we have adapted this assay to differentiate between constitutive and induced autophagy and to quantify the changes in flux of the system. Moreover, using direct antibody staining for the endogenous LC3 protein, we have extended this assay to the detection of autophagosome formation in non-transfected cells.