タンパク質キナーゼA Rialphaのキャンプ誘導性アロステリックスイッチを分析する

cAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）の調節サブユニットは、ほとんどの真核細胞のcAMPの主要な受容体です。環状ヌクレオチド結合（CNB）ドメインがcAMPを放出し、PKAの触媒サブユニットに結合すると、それらは大きな立体構造の変化を受けます。この変化は、CNB-AのB/Cヘリックスによって媒介されます。これは、2つのCNBドメインとドックを触媒サブユニットの表面に分離する1つの長いヘリックスにまで及びます。ここでは、触媒サブユニットにドッキングするB/Cヘリックスの3つの重要な残基の役割を探ります。Arg226、Leu233、および234を満たします。各残基をALAに置き換えることで、それぞれがR：C界面の作成に大きく貢献していることを示します。。また、2番目のCNBドメイン（CNB-B）を削除することにより、CNB-Bは、触媒サブユニットの表面からB/Cヘリックスを外すキャンプ誘発コンフォメーションスイッチの重要な部分であることを示します。CNB-Bなしでは、cAMPによる活性化のK（a）は80から1000 nmに増加します。キーインターフェイス残基のいずれかをALAに置き換えると、k（a）が25〜40 nmに減少します。LEU233およびM234は、B/CヘリックスをCサブユニットの大きなローブに結合する疎水性ラッチに寄与しますが、Arg226は、cAMPがドッキングされているリン酸塩結合カセットにB/Cヘリックスを網羅する静電スイッチの一部です。

The regulatory subunits of cAMP-dependent protein kinase (PKA) are the major receptors of cAMP in most eukaryotic cells. As the cyclic nucleotide binding (CNB) domains release cAMP and bind to the catalytic subunit of PKA, they undergo a major conformational change. The change is mediated by the B/C helix in CNB-A, which extends into one long helix that now separates the two CNB domains and docks onto the surface of the catalytic subunit. We explore here the role of three key residues on the B/C helix that dock onto the catalytic subunit, Arg226, Leu233, and Met 234. By replacing each residue with Ala, we show that each contributes significantly to creating the R:C interface. By also deleting the second CNB domain (CNB-B), we show furthermore that CNB-B is a critical part of the cAMP-induced conformational switch that dislodges the B/C helix from the surface of the catalytic subunit. Without CNB-B the K(a) for activation by cAMP increases from 80 to 1000 nM. Replacing any of the key interface residues with Ala reduces the K(a) to 25-40 nM. Leu233 and M234 contribute to a hydrophobic latch that binds the B/C helix onto the large lobe of the C-subunit, while Arg226 is part of an electrostatic switch that couples the B/C helix to the phosphate binding cassette where the cAMP docks.