精子表面上の19Sプロテアソーム調節複合体のサブユニットPSMD4との干渉は、ブタの肥大化中の精子ゾーナペルシダ浸透を阻害します

26Sプロテアソームによるユビキチン化精子および卵母細胞タンパク質のタンパク質分解は、哺乳類の肥料の成功に必要です。本研究では、in vitro（IVF）での精子ZP浸透におけるプロテアソームZP浸透におけるプロテアソーム層状認識の原因となるプロテアソーム19S調節複合体の不可欠な非ATPaseサブユニットであるPSMD4の役割を調べました。ブタの精子ZP浸透は、精子ZP結合ではなく、IVF中にモノクローナル抗PSMD4抗体の存在下でブロックされました。19Sの調節複合体による処理に耐えられ、アルツハイマー病に関連する変異ユビキチン（UB+1およびUB5+1）の受精媒体に含めることも受精を阻害します。この観察結果は、サブユニットPSMD4が精子先体の表面に露出していることを示唆しています。これは、非細胞浸透、ビオチン化プロテアソーム阻害剤ZL3Vが精子の先体への結合によってさらにサポートされています。精子先体における免疫蛍光局在PSMD4。免疫沈降とプロテオーム解析により、PSMD4はブタ精子関連のアクロシン阻害剤（AI）と共沈着したことが明らかになりました。AIのユビキチン化種は、P62タンパク質の組換えUBAドメインを使用して、ユビキチン化タンパク質の親和性精製により、イノシシの精子抽出物から分離されました。いくつかのプロテアソームは、共競合研究で記録されているように、精子頭の内性先体内膜に固定されているように見えました。結論として、19Sの規制複合体サブユニットPSMD4は、受精中の精子ZP浸透に関与しています。19sのプロテアソーム調節複合体によるZP上の基質の認識は、in vitroでのブタ/哺乳類の施肥の成功に不可欠です。

Proteolysis of ubiquitinated sperm and oocyte proteins by the 26S proteasome is necessary for the success of mammalian fertilization, including but not limited to acrosomal exocytosis and sperm-zona pellucida (ZP) penetration. The present study examined the role of PSMD4, an essential non-ATPase subunit of the proteasomal 19S regulatory complex responsible for proteasome-substrate recognition, in sperm-ZP penetration during porcine fertilization in vitro (IVF). Porcine sperm-ZP penetration, but not sperm-ZP binding, was blocked in the presence of a monoclonal anti-PSMD4 antibody during IVF. Inclusion in the fertilization medium of mutant ubiquitins (Ub+1 and Ub5+1), which are refractory to processing by the 19S regulatory complex and associated with Alzheimer's disease, also inhibited fertilization. This observation suggested that subunit PSMD4 is exposed on the sperm acrosomal surface, a notion that was further supported by the binding of non-cell permeant, biotinylated proteasomal inhibitor ZL3VS to the sperm acrosome. Immunofluorescence localized PSMD4 in the sperm acrosome. Immunoprecipitation and proteomic analysis revealed that PSMD4 co-precipitated with porcine sperm-associated acrosin inhibitor (AI). Ubiquitinated species of AI were isolated from boar sperm extracts by affinity purification of ubiquitinated proteins using the recombinant UBA domain of p62 protein. Some proteasomes appeared to be anchored to the sperm head inner acrosomal membrane, as documented by co-fractionation studies. In conclusion, the 19S regulatory complex subunit PSMD4 is involved in the sperm-ZP penetration during fertilization. The recognition of substrates on the ZP by the 19S proteasomal regulatory complex is essential for the success of porcine/mammalian fertilization in vitro.