チコリの体細胞胚形成に潜在的に関与する新しい遺伝子の同定（Cichorium Intybus L）

背景：私たちの研究室では、培養チコリ（Cichorium intybus）外植片を細胞の再活性化と体性胚形成を調査するモデルとして使用し、同様の遺伝的背景を共有する2つのチコリ遺伝子型（K59、C15）を生成しました。K59は、完全な細胞再活性化、すなわち細胞のde-および再分化を経験することができる応答性遺伝子型（胚形成）です。一方、C15は非応答性遺伝子型（非膜形成）であり、SEを受けることができません。以前の研究1は、チコリの根脱林における体細胞胚の産生をブロックしたアラビノガルタンタンパク質（AGP）を特異的に結合するベータ-D-グルコシルヤリブ試薬（ベータグレイ）の使用が示された。この観察結果は、ベータglcyがチコリの体性胚形成（SE）を調査するための有用なツールであることを示しています。さらに、推定AGP（DT212818）をコードする遺伝子は、非胚形成C15遺伝子型と比較して、胚形成K59チコリ遺伝子型で有意に上方制御されることが以前に発見されました。チコリのSEの根底にある分子および細胞調節の理解を改善するために、K59およびC15遺伝子型の細胞再活性化イベントの詳細な細胞学的研究を実施し、マイクロアレイプロファイリングを使用して、これら2つの遺伝子型の遺伝子発現を比較しました。さらに、このプロセスに潜在的に関与する遺伝子を識別するために、ベータグレイを使用してSEをブロックしました。 結果：顕微鏡では、C15遺伝子型ではなくK59のみが完全な細胞再活性化を受けたことが確認されました。外植片のベータglcy治療は、in vitro SE誘導をブロックしましたが、細胞の再活性化ではなく、細胞壁の修飾を誘導しました。マイクロアレイ分析により、78の遺伝子が誘導されたK59とC15の遺伝子型の間で差別的に発現されたことが明らかになりました。19個の遺伝子の発現プロファイルは、ベータglcy治療によって修飾されました。8つの遺伝子は、SE誘導中にK59とC15の遺伝子型の間で差次的に発現し、ベータglcy治療：AGP（DT212818）、26 sプロテソームAAA ATPaseサブユニット6（RPT6）、レモリン（REM）、メタロチオネイン1（MT1（MT1））、2つの非特異的脂質移動タンパク質遺伝子（SDI-9およびDEA1）、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAレダクターゼ（HMG-CoA還元酵素）、およびスナキン2（SN2）。これらの結果は、以前に特定されたAGP遺伝子（DT212818）を含む8つの遺伝子が、チコリのSEコミットメントにつながる細胞運命決定イベントに関与している可能性があることを示唆しています。 結論：SE誘導に対する反応性が異なる2つの異なるチコリ遺伝子型の使用は、ベータglcy治療とともに、SE形態形成経路から細胞の再活性化を識別するための効率的なツールを表しています。このようなアプローチは、マイクロアレイ分析とともに、チコリのSE形態形成経路に関連するいくつかの推定上の重要な遺伝子を特定することを許可しました。

BACKGROUND: In our laboratory we use cultured chicory (Cichorium intybus) explants as a model to investigate cell reactivation and somatic embryogenesis and have produced 2 chicory genotypes (K59, C15) sharing a similar genetic background. K59 is a responsive genotype (embryogenic) capable of undergoing complete cell reactivation i.e. cell de- and re-differentiation leading to somatic embryogenesis (SE), whereas C15 is a non-responsive genotype (non-embryogenic) and is unable to undergo SE. Previous studies 1 showed that the use of the beta-D-glucosyl Yariv reagent (beta-GlcY) that specifically binds arabinogalactan-proteins (AGPs) blocked somatic embryo production in chicory root explants. This observation indicates that beta-GlcY is a useful tool for investigating somatic embryogenesis (SE) in chicory. In addition, a putative AGP (DT212818) encoding gene was previously found to be significantly up-regulated in the embryogenic K59 chicory genotype as compared to the non-embryogenic C15 genotype suggesting that this AGP could be involved in chicory re-differentiation 2. In order to improve our understanding of the molecular and cellular regulation underlying SE in chicory, we undertook a detailed cytological study of cell reactivation events in K59 and C15 genotypes, and used microarray profiling to compare gene expression in these 2 genotypes. In addition we also used beta-GlcY to block SE in order to identify genes potentially involved in this process. RESULTS: Microscopy confirmed that only the K59, but not the C15 genotype underwent complete cell reactivation leading to SE formation. beta-GlcY-treatment of explants blocked in vitro SE induction, but not cell reactivation, and induced cell wall modifications. Microarray analyses revealed that 78 genes were differentially expressed between induced K59 and C15 genotypes. The expression profiles of 19 genes were modified by beta-GlcY-treatment. Eight genes were both differentially expressed between K59 and C15 genotypes during SE induction and transcriptionally affected by beta-GlcY-treatment: AGP (DT212818), 26 S proteasome AAA ATPase subunit 6 (RPT6), remorin (REM), metallothionein-1 (MT1), two non-specific lipid transfer proteins genes (SDI-9 and DEA1), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase), and snakin 2 (SN2). These results suggest that the 8 genes, including the previously-identified AGP gene (DT212818), could be involved in cell fate determination events leading to SE commitment in chicory. CONCLUSION: The use of two different chicory genotypes differing in their responsiveness to SE induction, together with beta-GlcY-treatment represented an efficient tool to discriminate cell reactivation from the SE morphogenetic pathway. Such an approach, together with microarray analyses, permitted us to identify several putative key genes related to the SE morphogenetic pathway in chicory.