電気泳動移動度の使用への小さなアンチセンスRNAの二次構造を決定する

天然アンチセンスRNAには、機能にとって重要なステムループ（ヘアピン）二次構造があります。ファージP22のSARアンチセンスRNAは珍しいです。分子の3 '半分は広範囲にわたるステムループを形成しますが、5'半分の潜在的な構造は熱力学的に安定していると予測されていません。多数のSAR変異体の非変性ゲルの電気泳動移動度を調べることにより、SAR RNAの二次構造を決定するための新しい方法を考案しました。結果は、野生型RNAが電気泳動の移動性を高める5 'ステムループを形成することを示しています。このヘアピンの茎を破壊するすべての変異は、RNAの可動性を低下させます。対照的に、茎を破壊せずに茎のシーケンスを変化させる突然変異（たとえば、G.UからA.Uへの変更）はモビリティに影響しません。構造の一本鎖領域のほぼすべての変異も、移動性に影響を与えません。提案された5 'ステムループの確認は、代償性二重変異体を構築および分析することにより得られました。茎のベースペアを回復する突然変異の組み合わせもモビリティを回復します。SAR変異体の遺伝表現型は、提案された二次構造が正しく、in vivoでのアンチセンスRNAの最適な活性に不可欠であることを確認しています。

Natural antisense RNAs have stem-loop (hairpin) secondary structures that are important for their function. The sar antisense RNA of phage P22 is unusual: the 3' half of the molecule forms an extensive stem-loop, but potential structures for the 5' half are not predicted to be thermodynamically stable. We devised a novel method to determine the secondary structure of sar RNA by examining the electrophoretic mobility on non-denaturing gels of numerous sar mutants. The results show that the wild-type RNA forms a 5' stem-loop that enhances electrophoretic mobility. All mutations that disrupt the stem of this hairpin decrease mobility of the RNA. In contrast, mutations that change the sequence of the stem without disrupting it (e.g. change G.U to A.U) do not affect mobility. Nearly all mutations in single-stranded regions of the structure also have no effect on mobility. Confirmation of the proposed 5' stem-loop was obtained by constructing and analyzing compensatory double mutants. Combinations of mutations that restore a base-pair of the stem also restore mobility. The genetic phenotypes of sar mutants confirm that the proposed secondary structure is correct and is essential for optimal activity of the antisense RNA in vivo.