タンパク質の蛍光消光：クエンチャーの浸透と外部消光メカニズムの区別

蛍光発光の動的な消光によって証明されているように、タンパク質に埋もれたTRP残基からさまざまな分子サイズの溶質を消光するQuenchingのアクセシビリティは、これらの高分子の構造変動を調査するのに役立ちます。ただし、球状の折り畳みを介したQ移動に関する消光速度の解釈には、溶媒中のQとの長距離相互作用などの代替反応経路が除外される必要があります。理論的には、外部の消光速度は、急速な拡散制限レジームへのコンプライアンスを想定することにより、通過相互作用の距離依存性から推定できます。タンパク質の蛍光症の外部消光に対する理論的予測の適用可能性を検証するために、アクリルアミドによるRNase T1およびパルブミンの埋もれたTRP残基の消光速度と、より大きな二重誘導体ビスクリラミドを比較しました。結果は、より大きなビサクリルアミドがアクリルアミドの2倍効率的であることを示しており、これらの表面的に埋められた残基について、反応は水相におけるアクリルアミドとの長距離相互作用によって支配されていることを意味します。溶媒粘度の消光速度定数k（q）の依存性をテストするために、クエンチング研究は、1〜120 cpのバルク粘度の範囲のグリセロール水溶液に拡張されました。最初の約2倍の増加とは別に、K（Q）は溶媒粘度とは無関係であることがわかったため、外部消光が急速な拡散制限レジームに厳密に準拠していることが示されています。実験は、外部消光速度に対するQサイズの影響を評価するために、より大きなアクリルアミド誘導体に拡張されました。

The accessibility of quenching solutes, Q, of various molecular sizes to buried Trp residues in proteins, as attested by dynamic quenching of their phosphorescence emission, is instrumental for probing structural fluctuations in these macromolecules. However, interpretation of quenching rates in terms of Q migration through the globular fold requires that alternative reaction pathways, such as long-range interactions with Q in the solvent, be ruled out. In theory, the external quenching rate can be estimated from the distance dependence of the through-space interaction by assuming compliance with the rapid diffusion limit regime. To validate the applicability of theoretical predictions to external quenching of protein phosphorescence, we compared the rate of quenching of the buried Trp residues of RNase T1 and parvalbumin by acrylamide and the bigger double-headed derivative bisacrylamide. The results showed that larger bisacrylamide is twice as efficient a quencher as acrylamide, implying that for these superficially buried residues the reaction is dominated by long-range interactions with acrylamide in the aqueous phase. To test the dependence of the quenching rate constant, k(q), on solvent viscosity, quenching studies were extended to glycerol-water solutions ranging in bulk viscosity from 1 to 120 cP. Apart from an initial about 2-fold increase, k(q) was found to be independent of solvent viscosity, thus demonstrating that external quenching rigorously complies with the rapid diffusion limit regime. Experiments were extended to larger acrylamide derivatives to evaluate the impact of Q size on the external quenching rate.