分子操作とタンパク質発現のための制限フリー（RF）クローニング手順の応用

DNAクローンや突然変異誘発を含む分子操作は、すべての生命科学分野で日常的に使用される基本的なツールです。過去10年間で、DNAクローンと突然変異誘発のアプリケーションを促進および拡大する新しい方法論が出現しました。ライゲーションに依存しないクローニング（LIC）手法が開発され、古典的なライゲーション依存クローニング（LDC）プラットフォームに置き換えられました。制限フリー（RF）クローニングは、もともと、あらゆる事前に決められた位置でプラスミドに外来DNAを導入するために開発されました。RFクローニングは、ベクターと挿入物の線形増幅のためのメガプライマーとして機能するDNAフラグメントのPCR増幅に基づいています。ここでは、DNAクローンと突然変異誘発のための制限フリー（RF）クローンプラットフォームのいくつかの新しいアプリケーションを提示します。新しいアプリケーションには、いくつかのDNAフラグメントが発現ベクター内の異なる位置への同時クローニング、同時多成分アセンブリ、および同じPCR産物の一連の異なるベクトルへの並列クローニングが含まれます。さらに、ターゲットDNAの複数の変化のためのRFクローニングプラットフォームの適用を拡張しました。これには、複数サイトの変異誘発と同時に、異なる位置での削除と挿入の同時導入が含まれます。さらに、大腸菌システムにおける組換えタンパク質発現を促進するための新しいアプリケーションの堅牢性を実証します。

Molecular manipulations, including DNA cloning and mutagenesis are basic tools used on a routine basis in all life-science disciplines. Over the last decade new methodologies have emerged that facilitated and expanded the applications for DNA cloning and mutagenesis. Ligation-Independent Cloning (LIC) techniques were developed and replaced the classical Ligation Dependent Cloning (LDC) platform. Restriction Free (RF) cloning was originally developed for introduction of foreign DNA into a plasmid at any predetermined position. RF cloning is based on PCR amplification of a DNA fragment, which serves as a mega-primer for the linear amplification of the vector and insert. Here we present several novel applications of the Restriction Free (RF) cloning platform for DNA cloning and mutagenesis. The new applications include simultaneous cloning of several DNA fragments into distinct positions within an expression vector, simultaneous multi-component assembly, and parallel cloning of the same PCR product into a series of different vectors. In addition, we have expanded the application of the RF cloning platform for multiple alterations of the target DNA, including simultaneous multiple-site mutagenesis and simultaneous introduction of deletions and insertions at different positions. We further demonstrate the robustness of the new applications for facilitating recombinant protein expression in the Escherichia coli system.