Par-Clip- RNA結合タンパク質の結合部位を識別する方法

RNA転写産物は、細胞型でしばしば依存して発現する数百のRNA結合タンパク質（RBP）およびマイクロRNA含有リボ核タンパク質複合体（miRNP）と相互作用することにより、転写後遺伝子調節にさらされます。これらのRNA結合因子の相互作用が個々の転写産物の調節にどのように影響するかを理解するには、in vivoタンパク質-RNA相互作用の高解像度マップが必要です。通常、遺伝的、生化学的、および計算的アプローチの組み合わせが適用され、RNA-RBPまたはRNA-RNP相互作用を特定します。免疫積分RBPS（RIP-CHIP）に関連するRNAのマイクロアレイプロファイリングは、トランスクリプトームレベルでターゲットを定義しますが、その適用は速度論的に安定した相互作用の特性評価に限定されており、まれな場合にのみ、長い認識要素（RRE）を識別することができます。ターゲットRNA。より直接的なRBPターゲットサイト情報は、in vivo UV架橋と免疫沈降と続いて、架橋RNAセグメントとcDNAシーケンス（CLIP）の分離を組み合わせることにより得られます。クリップを使用して、多くのRBPのターゲットを識別しました。ただし、CLIPはUV 254 nM RNAタンパク質架橋の低い効率によって制限され、架橋の位置は、配合された架橋フラグメント内で容易に識別できないため、バックグラウンドではないcrosslinkedの標的RNAセグメントを分離することが困難になります。RNAフラグメントもサンプルに存在します。強力な細胞ベースの架橋アプローチを開発して、高解像度でトランスクリプトーム全体を決定しました。方法の）。この方法は、4-チオリジン（4-Su）や6-チオグアノシン（6秒）などの光反応性リボヌクレオシド類似体の生殖RNA転写物への生殖RNA転写物への取り込みに依存しています。365 nmのUV光による細胞の照射は、光反応性ヌクレオシド標識細胞RNAの相互作用RBPへの効率的な架橋を誘導します。対象のRBPの免疫沈降の後に、架橋および共免疫沈降RNAの分離が続きます。分離されたRNAは、cDNAライブラリに変換され、SolExaテクノロジーを使用して深いシーケンスを測定します。パークリップで調製されたcDNAライブラリーの特徴の1つは、架橋の正確な位置を、配列決定されたcDNAに存在する変異によって識別できることです。4-SUを使用すると、架橋シーミジンチミジンからシチジン移行を使用するのに対し、6-sgを使用すると、グアノシンからアデノシン変異が得られます。架橋配列に変異が存在すると、豊富な細胞RNAから派生した配列の背景からそれらを分離することができます。多くの多様なRNA結合タンパク質への方法の適用は、Hafner et al。

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary. A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip) defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking with immunoprecipitation followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP). CLIP was used to identify targets of a number of RBPs. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample. We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs. Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.