in vitroでThromboSpondin-1およびAdamts13がVWF A2およびA3ドメインに競合的に結合する

はじめに：ADAMTS13（トロンボスポンディン1型繰り返しモチーフを備えたディスインテグリン様およびメタロプロテアーゼ13）は、VWF分解の主要なメタロプロテアーゼです。ADAMTS13欠乏症は、緩いVWFの蓄積を引き起こし、致命的な血栓症の血小板細胞性紫斑病（TTP）につながる可能性があります。Thrombospondin-1（TSP1）は、VWF二量体間のジスルフィド結合を標的とすることによりVWFのサイズを軽度にダウンレギュレートできるVWF（Von Willebrand因子）のレダクターゼと見なされます。TSP1は、ADAMTS13によるクリーブからVWFを保護する可能性があると報告されていますが、このVWF保護の根本的なメカニズムは不明のままであると報告されています。 材料と方法：ヒトVWFのフルレングスADAMTS13および異なるドメイン（A1、A2、A3）をそれぞれ構築および発現させました。各VWFドメインまたは全長VWFを使用したTSP1またはADAMTS13の結合能力は、酵素リンクされた免疫吸着アッセイを使用して調査されました。TSP1の異なる濃度によるADAMTS13活性の阻害は、変性条件下でのウエスタンブロットおよび残留コラーゲン結合アッセイ（R-CBA）によって観察されました。 結果：ADAMTS13がRVWF A1、A2、A3ドメインおよびフルレングスVWFと相互作用し、TSP1も3つのAドメイン、特にA2およびA3ドメインに結合することがわかりました。TSP1は、A2ドメイン、A3ドメイン、およびフル長VWFへの結合ADAMTS13を部分的にブロックしたことが観察されました。私たちのアッセイの結果は、TSP1がADAMTS13の活動を最大70％まで抑制できることを示しました。 結論：私たちの研究は、TSP1がVWFのADAMTS13結合と切断で競争的に抑制的な役割を果たし、A2およびA3ドメイン内で潜在的な競争が起こる可能性があることを示唆しました。

INTRODUCTION: ADAMTS13 (a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 repeat motif. 13) is the major metalloprotease for VWF degradation. ADAMTS13 deficiency causes the accumulation of uncleaved VWF and might lead to a lethal thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thrombospondin-1 (TSP1) is considered as a reductase of VWF (von Willebrand factor) which can mildly downregulate the size of VWF by targeting on disulfide bond between VWF dimers. It was reported that TSP1 might protected VWF from cleaving by ADAMTS13, yet the underlying mechanism of this VWF protection has remained unknown. MATERIALS AND METHODS: Full-length ADAMTS13 and different domains (A1,A2,A3) of human VWF were constructed and expressed respectively. The binding ability of TSP1 or ADAMTS13 with each VWF domain or full-length VWF was investigated by using enzyme linked immunosorbent assay. The inhibition of ADAMTS13 activities by the different concentrations of TSP1 were observed by western blot and residual-collagen binding assay (R-CBA) under the denaturing condition. RESULTS: We found that ADAMTS13 interacted with the rVWF A1, A2, A3 domains and full-length VWF, while TSP1 also bound to three A domains, especially to A2 and A3 domains. We observed that TSP1 partially blocked ADAMTS13 binding to A2 domain, A3 domain and full length VWF. The results of our assays showed that TSP1 could restrain ADAMTS13 activity up to 70%. CONCLUSIONS: Our study suggested that TSP1 played competitively inhibitory role in ADAMTS13 binding and cleaving of VWF, and the potential competition might happen within A2 and A3 domains.