蛍光タンパク質タグ付け用のユビキチン-10プロモーターベースのベクターセットは、一時的および安定した発現研究における時間的安定性と天然タンパク質分布を促進します

タンパク質の蛍光タグ付けと共焦点イメージング技術は、細胞内レベルでのタンパク質の分布と動的特性を分析する際に選択の方法になりました。一般的には、イメージングの前に準備時間を大幅に短縮する一時的な発現のための多くの戦略がありますが、それらのアプリケーションはいくつかの扱いやすい種や組織以外での成功に限られています。以前に、シロイヌナズナの根の表皮と根の毛で蛍光タグ付きタンパク質を一時的に発現する簡単な方法を開発しました。ここでは、シロイヌナズナのUbiqutin-10遺伝子プロモーター（P（UBQ10））を組み込んだ蛍光タグを備えた一連のゲートウェイ互換ベクターを説明します。安定的に変換されたラインを生成するのにも同様に役立ちます。原理の証明として、我々は、小胞をトラフィックするタンパク質のスネアファミリーのメンバーである積分原形質膜タンパク質Syp121と、反応性酸化剤種の除去を促進する細胞質タンパク質であるDHAR1の蛍光マーカーで変換を実施しました。また、SYP121およびその相互作用するパートナーであるKC1 K（+）チャネルとの変換を実施して、二分子蛍光補完（BIFC）の方法の有用性を実証しました。アグロバクテリウムの共培養法を使用したシロイヌナズナの一時的な変換は、根毛やガード細胞を含むすべての表皮細胞で発現をもたらしました。比較研究では、P（UBQ10）プロモーターがネイティブSYP121プロモーターによって駆動されるものと同様のレベルの発現を提供し、細胞内レベルでタンパク質分布の特性を忠実に再現することが示されました。35S主導の構成とは異なり、P（UBQ10）プロモーターの下での発現は、過渡形質転換後2週間を超える期間、上昇したままでした。ベクターと蛍光タグのこのツールボックスは、膜のダイナミクスと細胞発達の研究、ならびにガード細胞の環境刺激と根の栄養獲得に関連するイベントの研究に大きな利点を約束します。

Fluorescent tagging of proteins and confocal imaging techniques have become methods of choice in analysing the distributions and dynamic characteristics of proteins at the subcellular level. In common use are a number of strategies for transient expression that greatly reduce the preparation time in advance of imaging, but their applications are limited in success outside a few tractable species and tissues. We previously developed a simple method to transiently express fluorescently-tagged proteins in Arabidopsis root epidermis and root hairs. We describe here a set of Gateway-compatable vectors with fluorescent tags incorporating the ubiqutin-10 gene promoter (P(UBQ10) ) of Arabidopsis that gives prolonged expression of the fluorescently-tagged proteins, both in tobacco and Arabidopsis tissues, after transient transformation, and is equally useful in generating stably transformed lines. As a proof of principle, we carried out transformations with fluorescent markers for the integral plasma membrane protein SYP121, a member of the SNARE family of vesicle-trafficking proteins, and for DHAR1, a cytosolic protein that facilitates the scavenging of reactive oxygen species. We also carried out transformations with SYP121 and its interacting partner, the KC1 K(+) channel, to demonstrate the utility of the methods in bimolecular fluorescence complementation (BiFC). Transient transformations of Arabidopsis using Agrobacterium co-cultivation methods yielded expression in all epidermal cells, including root hairs and guard cells. Comparative studies showed that the P(UBQ10) promoter gives similar levels of expression to that driven by the native SYP121 promoter, faithfully reproducing the characteristics of protein distributions at the subcellular level. Unlike the 35S-driven construct, expression under the P(UBQ10) promoter remained elevated for periods in excess of 2 weeks after transient transformation. This toolbox of vectors and fluorescent tags promises significant advantages for the study of membrane dynamics and cellular development, as well as events associated with environmental stimuli in guard cells and nutrient acquisition in roots.