C型肝炎ウイルスNS5Bポリメラーゼ構造におけるリガンド誘導変化

ウイルス複製には、C型肝炎ウイルス（HCV）RNA依存性RNAポリメラーゼ（NS5B）が必要です。NS5Bアポタンパク質の結晶構造は、指と親指ドメインが相互作用して活性部位を囲むことを示し、親指フィンガー界面に結合するp495抵抗によって定義された阻害剤がΔ1フィンガーループを置き、この構造を破壊することを示しています。結晶構造は、溶液中のタンパク質の立体配座のすべてを明らかにしない可能性があるため、限られたトリプシンプロテアーゼ消化を使用して、Δ1ループの動きに対する基質の影響を調査するための代替方法を開発しました。このアッセイは、酵素活性をサポートする条件下でNS5Bを研究するために使用できます。阻害剤が存在しない場合、NS5Bの特定の領域はトリプシンに過敏ではなく、特定の中間切断産物は形成されませんでした。NS5BへのP495サイト阻害剤の結合は、リジン残基50および51で特定のトリプシン過敏症を誘導しました。以前に特徴付けられた阻害剤および変異体ポリメラーゼを使用して、この特定のトリプシン過敏症をΔ1ループの移動に結合しました。阻害剤パターンと同一のトリプシン過敏症は、RNAテンプレートの結合によって誘導されました。NS5Bテンプレート複合体にプライマーを添加すると、過敏症が排除されました。データは、テンプレートの結合により親指からのΔ1フィンガーループの変位と、プライマーまたはNTPの添加による反転と一致しています。我々の結果は、阻害剤と酵素の共結晶研究を補完し、アッセイは、機能的活性をサポートする条件下でHCV NS5Bポリメラーゼ立体構造の動的な変化を研究するための迅速かつ高感度の方法を提供します。

Hepatitis C virus (HCV) RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) is required for viral replication. Crystal structures of the NS5B apoprotein show that the finger and thumb domains interact to encircle the active site, and that inhibitors defined by P495 resistance that bind to the thumb-finger interface displace the Δ1 finger loop and disrupt this structure. Since crystal structures may not reveal all of the conformations of a protein in solution we have developed an alternative method, using limited trypsin protease digestion, to investigate the impact of inhibitors as well as substrates on the movement of the Δ1 loop. This assay can be used to study NS5B under conditions that support enzymatic activity. In the absence of inhibitors, no specific region of NS5B was hypersensitive to trypsin, and no specific intermediate cleavage products were formed. Binding of P495-site inhibitors to NS5B induced specific trypsin hypersensitivity at lysine residues 50 and 51. Previously characterized inhibitors and mutant polymerases were used to link this specific trypsin hypersensitivity to movement of the Δ1 loop. Trypsin hypersensitivity identical to the inhibitor pattern was also induced by the binding of the RNA template. The addition of primer to the NS5B-template complex eliminated the hypersensitivity. The data are consistent with displacement of the Δ1 finger loop from the thumb by the binding of template, and reversal by the addition of primer or NTP. Our results complement inhibitor-enzyme co-crystal studies, and the assay provides a rapid and sensitive method to study dynamic changes in HCV NS5B polymerase conformation under conditions that support functional activity.