イソチアゾールの生物活性化：創薬における潜在的な毒性のリスクを最小限に抑える

化合物1、（7-メトキシ-N-（（6-（3-メチルイソチアゾール-5-イル） - [1,2,4]トリアゾロ[4,3-B]ピリダジン-3-イル）メチル）-1、5-naphthyridin-4-アミン）は、癌でしばしば調節される受容体チロシンキナーゼであるC-MET（間葉系上皮遷移因子）の強力で選択的阻害剤です。化合物1は、複数の前臨床種で望ましい薬物動態特性を示しました。肝臓ミクロソームでのグルタチオントラッピング研究により、グルタチオンコンジュゲートのNADPH依存性形成が生じました。化合物1は、ミクロソームタンパク質への非常に高いin vitro NADPH依存性共有結合も示しました。共有結合の種の違いが観察され、ラット、マウス、サル（1100-1300 pmol/mg/h）で最高の結合があり、その後に犬（400 pmol/mg/h）と人間（144 pmol/mg/hが続きます。）。タンパク質へのこの共有結合は、グルタチオンとの併用により廃止されました。一緒に、これらのin vitroデータは、共有結合結合とグルタチオンの結合が生物活性化を介して化学的に反応性の中間体に進行することを示唆しています。この生物活性化に関与するシトクロム（CYP）P450酵素は、ヒトおよびシトクロムP450 2A2、3A1、および3A2でシトクロムP450 3A4、1A2、および2D6として同定されました。グルタチオン代謝産物はラットとマウスの胆汁で検出され、in vivoで発生する生物活性化が示されました。グルタチオン付加物の構造を解明する努力により、NMRおよび質量分析による代謝産物の分離と特性評価につながりました。分析データは、グルタチオンの結合がイソチアゾール環の4-C位置にあることを決定的に確認しました。イソチアゾールまたはチアゾール基のこのようなP450を介した生物活性化は以前に報告されていません。硫黄酸化を介した生物活性化のメカニズムを提案し、続いて4位でグルタチオン攻撃を行い、その後の水の損失をもたらし、グルタチオンコンジュゲートの形成をもたらします。毒性の潜在的なリスクを最小限に抑えるために、効力や薬物動態を損なうことなく生物活性化を減らす努力が行われました。イソチアゾール基の例示的な薬物動態/薬力学（PK/PD）特性により、最初の試みは分子に代替の代謝ソフトスポットを導入することに焦点を合わせました。これらの努力により、7-（2-メトキシエトキシ）-N-（（6-（3-メチル-5-イソチアゾリル）[1,2,4]トリアゾロ[4,3-B]ピリダジン-3-イルが発見されました。）メチル）-1,5-ナフチリジン-4-アミン（化合物2）、主要な代謝形質転換がナフチリジン環アルコキシ置換基で発生します。ただし、化合物2のグルタチオンコンジュゲートは、化合物1で観察されたものと同様の方法でin vitroおよびin vivoで生成されました。さらに、共有結合は種間で高かった（360、300、529、208、および98 pmol/mg/ラット、マウス、犬、猿、および人間のh）が、グルタチオンとの共インコレーションは、共有結合の程度を減少させました。生物活性化の削減における2番目の実行可能な代替手段は、イソチアゾール環をバイオイソステリックヘテロサイクルに置き換えることを伴いました。イソチアゾール環をイソキサゾールまたはピラゾールに置き換えると、化合物1および2の望ましいPK/PD特性を保持しながら、生体活性化が減少しました。

Compound 1, (7-methoxy-N-((6-(3-methylisothiazol-5-yl)-[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl)methyl)-1,5-naphthyridin-4-amine) is a potent, selective inhibitor of c-Met (mesenchymal-epithelial transition factor), a receptor tyrosine kinase that is often deregulated in cancer. Compound 1 displayed desirable pharmacokinetic properties in multiple preclinical species. Glutathione trapping studies in liver microsomes resulted in the NADPH-dependent formation of a glutathione conjugate. Compound 1 also exhibited very high in vitro NADPH-dependent covalent binding to microsomal proteins. Species differences in covalent binding were observed, with the highest binding in rats, mice, and monkeys (1100-1300 pmol/mg/h), followed by dogs (400 pmol/mg/h) and humans (144 pmol/mg/h). This covalent binding to protein was abolished by coincubation with glutathione. Together, these in vitro data suggest that covalent binding and glutathione conjugation proceed via bioactivation to a chemically reactive intermediate. The cytochrome (CYP) P450 enzymes responsible for this bioactivation were identified as cytochrome P450 3A4, 1A2, and 2D6 in human and cytochrome P450 2A2, 3A1, and 3A2 in rats. The glutathione metabolite was detected in the bile of rats and mice, thus demonstrating bioactivation occurring in vivo. Efforts to elucidate the structure of the glutathione adduct led to the isolation and characterization of the metabolite by NMR and mass spectrometry. The analytical data confirmed conclusively that the glutathione conjugation was on the 4-C position of the isothiazole ring. Such P450-mediated bioactivation of an isothiazole or thiazole group has not been previously reported. We propose a mechanism of bioactivation via sulfur oxidation followed by glutathione attack at the 4-position with subsequent loss of water resulting in the formation of the glutathione conjugate. Efforts to reduce bioactivation without compromising potency and pharmacokinetics were undertaken in order to minimize the potential risk of toxicity. Because of the exemplary pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) properties of the isothiazole group, initial attempts were focused on introducing alternative metabolic soft spots into the molecule. These efforts resulted in the discovery of 7-(2-methoxyethoxy)-N-((6-(3-methyl-5-isothiazolyl)[1,2,4]triazolo[4,3-b]pyridazin-3-yl)methyl)-1,5-naphthyridin-4-amine (compound 2), with the major metabolic transformation occurring on the naphthyridine ring alkoxy substituent. However, a glutathione conjugate of compound 2 was produced in vitro and in vivo in a manner similar to that observed for compound 1. Furthermore, the covalent binding was high across species (360, 300, 529, 208, and 98 pmol/mg/h in rats, mice, dogs, monkeys, and humans, respectively), but coincubation with glutathione reduced the extent of covalent binding. The second viable alternative in reducing bioactivation involved replacing the isothiazole ring with bioisosteric heterocycles. Replacement of the isothiazole ring with an isoxazole or a pyrazole reduced the bioactivation while retaining the desirable PK/PD characteristics of compounds 1 and 2.