トランスジェニッククローン化された牛の牛乳で発現する野生型および組換えヒトラクトフェリンの部位特異的N-グリコシル化の包括的な特性評価

グリカン部分は糖タンパク質の生物学的特性に重要な役割を果たすことができるため、組換えタンパク質のグリコシル化プロファイルは重要です。ここでは、トランスジェニッククローン化された牛の牛乳で発現するヒトラクトフェリン（HLF）および組換えヒトラクトフェリン（RHLF）の部位特異的N-グリコシル化プロファイルを決定しました。単糖組成分析、レクチンブロット、グリカン透過性、および連続的なエキソグリコシダーゼ消化の複合アプローチを使用し、高速イオンクロマトグラフィーと質量分析（MS）を使用してサンプルを分析しました。HLFのN-グリカンは、完全に分岐した高度にシアリル化され、高度にフコシル化された複合体型構造で構成されており、多くはルイス（X）エピトープを含んでいます。これらの構造のうち6つが初めてここで報告されます。ただし、RHLFのN-グリカンは、N-アセチルネルミン酸とフコースが少ない、高、ハイブリッド型、複合型構造です。一部には、末端N-アセチルガラクトサミン-N-アセチルグルコサミン（Lacdinac）二糖シーケンスが含まれています。RHLFの単糖組成分析により、少量のN-グリコリルネーラミン酸が明らかになりましたが、これはMSで検出されませんでした。HLFとRHLFは、ASN138とASN479の同じ2つのサイトでグリコシル化されているようです。ASN624の3番目の推定グリコシル化部位は、HLFとRHLFの両方で非グリコシル化されています。各サイトでの各N-グリカンの相対的な存在量も決定されました。HLFと比較した場合のRHLFの異なるN-グリコシル化プロファイルは、グリコシル化が種および組織/細胞特異的であるという広く保持されている見解と一致しています。これらのデータは、HLFとRHLFのグリカン構造/機能関係のさらなる研究の重要な基盤を提供し、ウシ乳腺上皮細胞のグリコシル化メカニズムをよりよく理解するのに役立ちます。

The glycosylation profile of a recombinant protein is important because glycan moieties can play a significant role in the biological properties of the glycoprotein. Here we determined the site-specific N-glycosylation profile of human lactoferrin (hLF) and recombinant human lactoferrin (rhLF) expressed in the milk of transgenic cloned cattle. We used combined approaches of monosaccharide composition analysis, lectin blot, glycan permethylation and sequential exoglycosidase digestion and analyzed samples using high-performance ion chromatography and mass spectrometry (MS). N-glycans from hLF are comprised entirely of highly branched, highly sialylated and highly fucosylated complex-type structures, and many contain Lewis(x) epitopes. Six of these structures are reported here for the first time. However, N-glycans from rhLF are of the high mannose-, hybrid- and complex-type structures, with less N-acetylneuraminic acid and fucose. Some contain a terminal N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine (LacdiNAc) disaccharide sequence. Monosaccharide composition analysis of rhLF revealed small amounts of N-glycolylneuraminic acid, which were not detected by MS. hLF and rhLF appear to be glycosylated at the same two sites: Asn138 and Asn479. The third putative glycosylation site, at Asn624, is unglycosylated in both hLF and rhLF. The relative abundance of each N-glycan at each site was also determined. The different N-glycosylation profile of rhLF when compared with that of hLF is in consistent with the widely held view that glycosylation is species- and tissue/cell-specific. These data provide an important foundation for further studies of glycan structure/function relationships for hLF and rhLF and help to better understand the glycosylation mechanism in bovine mammary epithelial cells.